C. elegans é um modelo útil para estudar os efeitos do etanol no comportamento. Apresentamos um ensaio comportamental que quantifica os efeitos do etanol na velocidade de locomoção de vermes rastejantes; tanto a sensibilidade inicial quanto o desenvolvimento de tolerância funcional aguda ao etanol podem ser medidos com este ensaio.
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Artigo de método
Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os transtornos por uso de álcool são uma preocupação significativa de saúde pública, para a qual existem poucas estratégias de tratamento eficazes. Uma dificuldade que atrasou o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes é a relativa falta de compreensão das bases moleculares dos efeitos do etanol no comportamento. O nematoda, Caenorhabditis elegans (C. elegans), fornece um modelo útil para gerar e testar hipóteses sobre os efeitos moleculares do etanol. Aqui, descrevemos um ensaio que foi desenvolvido e usado para examinar os papéis de genes particulares e fatores ambientais nas respostas comportamentais ao etanol, nas quais a locomoção é a saída comportamental. O etanol causa uma depressão aguda da rastejamento em uma superfície de ágar de maneira dependente da dose. Os efeitos são dinâmicos; animais expostos a uma alta concentração demonstram uma forte depressão inicial do rastejamento, referida aqui como sensibilidade inicial, e então recuperam parcialmente a velocidade de locomoção apesar da presença contínua do medicamento. Esta plasticidade comportamental induzida pelo etanol é referida aqui como o desenvolvimento de tolerância funcional aguda. Este ensaio tem sido usado para demonstrar que esses dois fenótipos são distintos e geneticamente separáveis. O ensaio de locomoção simples descrito aqui é adequado para examinar os efeitos de manipulações genéticas e ambientais nessas respostas comportamentais agudas ao etanol em C. elegans.
Introdução
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Os transtornos por uso de álcool (AUD) são generalizados e produzem sérios problemas de saúde, sociais e econômicos. Nos humanos, a suscetibilidade a desenvolver um AUD é fortemente influenciada tanto pela genética quanto pelo ambiente1,2. Um forte preditor fisiológico de potencial de abuso é o nível inicial de resposta (LR) ao álcool (etanol) que é exibido por bebedores inexperientes3-5. Este fenótipo LR é influenciado por componentes genéticos e não genéticos6. Determinar os mecanismos moleculares que influenciam a LR ao etanol é um objetivo importante do estudo dos comportamentos de resposta ao etanol.
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Protocolo
1. Passos para executar no dia anterior ao ensaio
- Escolha L4 vermes palco para meio de crescimento nematóide fresco (NGM) placas semeadas com um gramado de OP50 E. coli e cultura-los em 20 CO / N. Cada condição de ensaio requer 10 vermes; escolher um excesso de vermes para permitir O perda de vermes / N.
- Apenas animais de ensaio que são adultos do primeiro dia; muitos mutantes crescer a uma velocidade mais lenta do que o tipo selvagem. Ajuste o tempo de colheita para as estirpes que têm atrasos de desenvolvimento, de modo que todos os animais testados são adultos do primeiro dia.
2. Passos a exec....
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Resultados
Os dados representativos (Figura 1) de vários genótipos diferentes e seus controles pareados são apresentados 8,24; dados foram escolhidos especificamente que as diferenças de destaque nos animais testados. O grau de efeito de 10 min de exposição é considerada a sensibilidade inicial de uma estirpe, que é mostrada nos eixos esquerda na Figura 1B-G. Estirpes mutantes com uma maior velocidade relativa do que o controlo em 10 minutos são considerados como sendo resistentes etano.......
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Discussão
A neurobiologia simples e ferramentas genéticas disponíveis em C. elegans fazer o sem-fim um excelente modelo para estudar as bases moleculares dos efeitos do etanol sobre o comportamento. Aqui, nós descrevemos um ensaio que foi utilizado para identificar vários mediadores moleculares e ambientais da resposta comportamental aguda para ethanol 8,10,20,24,25. Este método permite a diferenciação e análise simultânea de dois fenótipos diferentes comportamento de resposta etanol, sensibilidade inicial e o.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Estes estudos foram apoiados por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Alcoolismo e Abuso de Álcool: R01AA016837 (JCB) e P20AA017828 (AGD e JCB).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Placas de Petri de 60 x 15 mm, com três ventilações | Greiner Bio-One | 628161 | Outras marcas de placas servirão. |
| Ágar NGM | Vários | NaCl (3 g/L), ágar (17 g/L), peptona (2,5 g/L), 1 ml de colesterol (5 mg/ml em etanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Fórceps | Vários | por exemplo, Fisher Scientific #10300 | |
| Incubadora a 37 °C | Vários | Para secar o ágar | |
| Balança digital | Vários | Para determinar pesos de placas e volume de ágar | |
| Anéis de cobre | Plumbmaster | STK#35583 (48 rosca de tampa vedante) | Anéis de cobre com 1,6 cm de diâmetro interno e 1,8 cm de diâmetro externo |
| Etanol 100% | Vários | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| Câmera CCD | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | Esta câmera tem um grande campo de visão. |
| Estereomicroscópio com montagem C e objetivo 0,5X | Leica | MZ6 | Modelo descontinuado, M60 é o equivalente atual. |
| Fonte de luz | Schott | A08923 | Iluminação de fundo de 7,6 x 7,6 cm para iluminação uniforme em todo o campo de visão |
| Software de imagem e rastreamento | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Versões mais recentes do software têm funções de rastreamento. |
Referências
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Schuckit, M. A. Genetics of the risk for alcoholism.
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Reimpressões e permissões
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