ВЭЖХ Измерение ДНК окисления биомаркер, 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин, в культивируемых клетках и тканях животных
Summary
Целью этого протокола является определение степени окисления ДНК-маркера, 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo) с помощью ВЭЖХ-ЭД, в ДНК из культивируемых клеток или тканей животных.
Abstract
Оксидативный стресс, связанный с многих физиологических и патологических процессов, а также метаболизма ксенобиотиков, приводит к окислению биомакромолекул, в том числе ДНК. Таким образом, эффективность обнаружения окисления ДНК важно для различных исследовательских дисциплин, в том числе медицины и токсикологии. Общий биомаркер окислительного поврежденной ДНК является 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo; часто ошибочно называют 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин (8-OH-dGuo или 8 оксо-DG)). Несколько протоколов для 8-оксо-dGuo измерения методом жидкостной хроматографии под высоким давлением с электрохимическим детектированием (ВЭЖХ-ЭД) были описаны. Тем не менее, они были в основном применяется для очищенной ДНК, обработанной прооксидантов. Кроме того, из-за методологических различий между лабораториями, в основном из-за различий в аналитическом оборудовании, принятие опубликованных методов обнаружения 8-оксо-dGuo по ВЭЖХ-ЭД требуется тщательная оптимизация по каждой лаборатории.комплексный протокол, описывая такой процесс оптимизации, не хватает. Здесь Подробный протокол описан для обнаружения 8-оксо-dGuo с помощью ВЭЖХ-ЭД, в ДНК из культивируемых клеток или тканей животных. Это показывает, как подготовка проб ДНК может быть легко и быстро оптимизированы, чтобы свести к минимуму нежелательное окисление ДНК, которые могут возникнуть при подготовке пробы. Этот протокол показывает, как определить 8-оксо-dGuo в культивированных человеческих клеток аденокарциномы альвеолярного (т.е. клетки А549), обработанные с окислителем KBrO 3, и из селезенки мышей, подвергнутых воздействию полициклических ароматических углеводородов дибензо (DEF, р) хризена (DBC, ранее известный как дибензо (, л) пирена, DalP). В целом, эта работа показывает, как методика ВЭЖХ-ЭД может быть легко оптимизирована для обнаружения 8-оксо-dGuo в биологических образцах.
Introduction
Активные формы кислорода (АФК), чьи стационарное уровни могут увеличить в течение многих патологических состояний и xenotoxic метаболизма, способствует увеличению частоты окислительного повреждения ДНК. Среди нескольких возможных нуклеотидных продуктов окисления, окислительного повреждения ДНК легко может быть измерена с помощью стабильного маркер 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo), который является одним из окисленных форм 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-оксо-dGuo является наиболее распространенным поражение DNA 2, и, следовательно, был изучен более подробно в качестве биомаркера окисления ДНК, несмотря на существование нескольких продуктов окисления ДНК 3. В людях, это повреждение можно отремонтировать с помощью базовой ремонта вырезания на 8-оксогуанин гликозилазы 1 (hOGG1) 4. Если осталось без ремонта, 8-оксо-dGuo может способствовать формированию базовых мутаций пара-замещение (т.е. е к т трансверсии) 4. Важно отметить, что 8-оксо-dGuo является установленным маркером FOг повреждение ДНК в отношении установления и развития канцерогенеза 2. Таким образом, точное определение количества 8-оксо-dGuo является полезным и желательным биомаркер окислительного повреждения ДНК 5.
Существует распространенное заблуждение в литературе о правильных названий окислительно-поврежденных форм 2-дезоксигуанозина и, кроме того, правильное название соединения (ий) обычно измеряется в качестве биомаркеров окислительного повреждения ДНК 6. В 6,8-дикето и 6-енольные, 8-кето таутомерные формы 8-оксо-dGuo (показано на рисунке 1) являются двумя наиболее видные таутомерам, обсуждаемые в литературе 5,7. Форма 6,8-дикето является наиболее заметной формой при физиологическом рН 7,4, и наиболее заметным продуктом окисления ДНК 7. Таким образом, 8-оксо-dGuo, а не 8-гидрокси-dGuo является наиболее подходящее название для этого продукта окисления 6. Важно также отметить, что 2-дезоксигуанозин (dGuo), а не nucleobаза гуанин (гуа) или рибонуклеозид гуанозин (Го), соответственно, обнаружена в большинстве методов 6.
Точное обнаружение и количественное определение 8-оксо-dGuo является сложной задачей из-за: я) изменчивости в переваривании образца ДНК, II) случайный окисление dGuo 8-оксо-dGuo, которые могут возникнуть во время подготовки образца, и III) необходимость для эффективного проверки результаты анализа методом ВЭЖХ-ЭД 8. В этом протоколе, мы нацелены на достижение I), обеспечивая условия, благоприятные для полного переваривания ДНК и б) путем включения хелатор металла и хелаторных обработанных растворов и специального ДНК-выделении реагента, а III) был только частично решены путем включения Положительные контроли и, таким образом, обеспечивая, что метод способен обнаруживать 8-оксо-dGuo в биологических образцах. Кроме того проверка выходит за рамки данной статьи. Тем не менее, мы уверены, что этот протокол поможет перспективнымпользователи определяют степень, до которой они должны формально подтвердить протокол, в зависимости от их целей. Перечень шагов, необходимых для формального проверки метода обеспечивается дальше. В ходе разработки и развертывания метода для обнаружения 8-оксо-dGuo, опубликованных методов были рассмотрены и консолидированы. Таким образом, этот метод устраняет необходимость сбора информации из нескольких опубликованных источников, которые зачастую не имеют важные экспериментальные детали, а также предоставляет быстрый и простые средства тестирования, если метод обнаружения и количественного определения 8-оксо-dGuo успешно принят. Это адаптировать метод был использован для успешного анализа образцов ДНК из культивируемых клеток мышиной и ткани. Это видео статья поможет другим группам в создании эффективного способа для надежного обнаружения и количественного определения 8-оксо-dGuo по ВЭЖХ-ЭД.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя 8-оксо-dGuo сообщалось полезным биомаркеров окисления ДНК, его надежность количественное может создать проблему. Хотя существует несколько опубликованных методов, есть необходимость всеобъемлющего, описательной обзор протокола, чтобы позволить исследователям развернуть метод в ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано Канада геномики исследований и развития инициативы в области здравоохранения (GRDI) и Стратегии канадской регулированию в области биотехнологии (CRSB). Авторы не имеют конфликта интересов.
Materials
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
Referências
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2′ -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- . . Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).
