Xenopus laevis als een model te identificeren Vertaling Impairment
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
Eiwitsynthese is een fundamenteel proces om genexpressie beïnvloeden diverse biologische processen name aanpassing aan de omgevingsomstandigheden. De initiatiestap, waarbij het samenstel van de ribosomale subeenheden van het mRNA initiatiecodon, betrokken initiatiefactor inclusief eIF4G1 gaat. Defecten in deze snelheidsbeperkende stap van de vertaling zijn gekoppeld aan diverse stoornissen. Om de mogelijke gevolgen van een dergelijke deregulering studeren, Xenopus laevis oöcyten vormen een aantrekkelijk model met een hoge mate van bescherming van de essentiële cellulaire en moleculaire mechanismen met menselijke. Bovendien, tijdens de meiose rijping, eicellen worden transcriptioneel onderdrukt en alle benodigde eiwitten worden vertaald uit het reeds bestaande, maternale mRNA's. Deze goedkope model stelt exogeen mRNA perfect geïntegreerd met een effectieve vertaling geworden. Hier wordt beschreven een protocol voor de beoordeling van vertalingen met een factor van belang (hier eIF4G1) met behulp van stored maternale mRNA die het eerst worden gepolyadenyleerde en omgezet in eicelrijping als fysiologische uitlezing. Aanvankelijk mRNA gesynthetiseerd door in vitro transcriptie van plasmiden van belang (hier eIF4G1) geïnjecteerd in oöcyten en kinetiek van eicelrijping door kiemblaasje Breakdown detectie bepaald. De bestudeerde maternale mRNA doel de serine / threonine-proteïne-kinase mos. De polyadenylatie en de latere vertalingen worden onderzocht samen met de expressie en fosforylering van eiwitten van de mos signaleringscascade betrokken bij eicelrijping. Variaties van het huidige protocol naar voren translationeel defecten worden ook voorgesteld om de algemene toepasbaarheid benadrukken zetten. Gezien wordend bewijs dat afwijkende eiwitsynthese betrokken kan zijn bij de pathogenese van neurologische aandoeningen, zoals een model biedt de mogelijkheid om deze uitholling gemakkelijk evalueren en nieuwe targets.
Introduction
Eiwitten zijn essentiële onderdelen van cellulaire leven en derhalve op grotere schaal van het organisme. Zij zorgen voor de meeste cellulaire functies waaronder de structuur, transport reactie katalyse, regulering, genexpressie etc. Hun expressie is het resultaat van een complex mechanisme van translatie voor de conversie van een mRNA in eiwit. De vertaling wordt onderworpen aan diverse controles aan te passen en om genexpressie te reguleren volgens de cel nodig, tijdens de ontwikkeling en differentiatie, veroudering, fysiologische stress of pathologische verschijnselen.
Vertaling is verdeeld in 3 fasen (initiatie, verlenging en beëindiging) en presenteert 3 initiatie vertaling systemen om in te spelen op deze behoeften: cap-afhankelijke, cap-onafhankelijke via interne Ribosoom Entry Segment (IRES) structuren en cap-onafhankelijke Vertaling Enhancers ( CITE).
De meeste eukaryote mRNA wordt vertaald in een cap-dependent wijze via de 7-methylguanosine 5'-trifosfaat cap die dient als een erkenning waarde tijdens eiwitsynthese. Deze kap eIF4E bindt aan een component van eIF4F complex met eIF4G1 en eIF4A. Geassocieerd met andere partners zoals poly (A) Binding Protein (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met deze translatie initiatie factoren laten circulariseren mRNA en verbetering van de toegankelijkheid formulieren 43S complex tot augustus initiatiecodon erkenning 1. Deze gebeurtenis geeft het einde van de translatie initiatie dwz de eerste stap van de vertaling.
Cap-onafhankelijke translatie wordt door mRNA coderen voor essentiële proteïnen onder stressomstandigheden dat induceren bijvoorbeeld celproliferatie en apoptose. Het mechanisme omvat secundaire structuren in mRNA 5'-onvertaalde gebied (UTR) genoemd IRES, de carboxy-eindstandige uiteinde van eIF4G1 geassocieerd met eIF4A en 43S complex. De binding van deze 43S pre-initiatie complex aan IRES initieert de dop onafhankelijke vertaling zonder de noodzaak voor eIF4E factor 2,3.
Tot slot, een andere vertaling mechanisme nog niet goed begrepen ondersteunt deze cap-onafhankelijke vertaling activiteit onder benadrukt omstandigheden via CITE structuren zich binnen mRNA UTR 4.
Door deze verschillende wijzen van translatie verschillen hun initiatie stappen translatie speelt een cruciale rol in de cellulaire homeostase en een verandering in één van deze processen zou dus invloed het organisme met kleine tot grote gevolgen. Inderdaad, de initiatie is een snelheidsbeperkende stap voor de juiste vertaling processen van mRNA in eiwitten en is daarmee het doelwit van tal van controles en regelgeving 5 punten. Of het aan de laatste of onderdelen van deze processen, wanneer men blijkt vertoont, zal het vastgestelde evenwicht in de cel verstoren en aldus kunnen leiden tot pathologische condigen. In deze context hebben mutaties in vertaling factoren die betrokken zijn geweest bij verschillende aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen zoals `leuko-encefalopathie met vanishing white matter' (eIF2B1-5 subunit) 6, in Walcott-Rallison syndroom (EIF2AK3 gen dat codeert voor PERK) 7, potentieel in ziekte van Parkinson (eIF4G1 p.R1205H) 8. Het is daarom belangrijk om cellulaire en moleculaire studies van deze mutante proteïnen voeren om onze kennis te vergroten op ontwikkeling van de ziekte en de algemene werkwijze van translatie initiatie.
Om deze studies uit te voeren, is het noodzakelijk om de meest geschikte modellen kiezen om de gevolgen van deze mutaties in acht Xenopus laevis oöcyten zijn bijzonder geschikt vanwege hun fysiologische en biochemische eigenschappen. Fysiologische synchroniciteit (geblokkeerd in fase G2 van de celcyclus) , hoge capaciteit van de eiwitsynthese (200-400 ng / dag / eicel), hoog aantal gewonnen OOCYtes uit hetzelfde dier (800-1000 eicellen / vrouw) en de grootte cel (1,2-1,4 mm diameter), die hun manipulatie vergemakkelijkt. Micro-injectie van Xenopus oöcyten met gesynthetiseerde mRNA kan gemakkelijk worden uitgevoerd om vertalingsstappen ontleden. In deze visie presenteert andere voordelen. Gezien de snelheid van de meiose en progressie van de vertaling na mRNA micro-injectie (~ 24 uur), Xenopus eicel is een snel systeem in vergelijking met opgeloste cellulaire systemen (gewonnen uit E. coli, tarwekiemen of konijn reticulocyten …) waarin een mRNA is vertaald met een verminderde vertaling tarief en op een lagere snelheid. Zo zullen de effecten van een mutatie geïntroduceerd in een mRNA snel en gemakkelijk waarneembaar bestudeerd in verschillende oöcyten. Een ander voordeel van Xenopus oöcyten is dat moeders mRNA's zijn latent en eiwit vertaling wordt geblokkeerd voordat progesteron stimulatie. Toevoeging van progesteron is dus een goede manier van reguleren van de translatie inductie. Cytoplasmatische polyadenylation niet optreden tijdens oögenese. Het begint tijdens maturatie van progesteron-gestimuleerde oöcyten in een tijdsvolgorde en blijft gedurende de vroege ontwikkeling en kan worden gebruikt om de verschillende stappen van taalstudie.
De polyadenylatie van mos mRNA is een van de eerste die zich voordoen en het behoort met Aurora A / EG2, Histon-Like B4 mRNA tot de klasse van de "vroege rijping" genen, zoals gedefinieerd in Charlesworth et al. (2004) 9. De translationele inductie van "late" mRNA zoals Cycline A1 en cycline B1 optreedt ten tijde van germinal vesicle afbraak (GVBD). Mos mRNA codeert voor een serine / threonine-proteïne kinase. De vertaling is van cruciaal belang, omdat het leidt tot het MAP-kinase cascade die indirect activeert de eicel rijping. Inderdaad, in reactie op progesteron, polyadenylatie van mos mRNA versterkt via werkwijzen waarbij Aurora A / EG2 regulerende eiwitten en andere RNA-bindende eiwitten met the 3'UTR van mos mRNA. Deze verhoogde polyadenylatie van mRNA mos leidt tot een toename van mos eiwitgehalte, dat op zijn beurt activeert MEK1. Dit proces medieert de activering van het extracellulaire signalen gereguleerde kinase 2 (ERK2) (Figuur 1). Deze signalerende cascade kan dan leiden tot de maturatie M-fase-bevorderende factoren, een complex gevormd door Cycline B Cdc2 kinase, en resulteert uiteindelijk in meiotische hervatting.
Daarom in Xenopus laevis oocyten, kan het onderzoek van maternale mRNA zoals mos gemakkelijk worden gebruikt om de vertaalbaarheid testen met verscheidene eindpunten van de efficiënte polyadenylatie translatie van verscheidene MOS signaleringscomponenten, waaronder ook het bepalen van de GVBD rate. Dit systeem is dus interessant om de eerste gevolgen van mutaties in translatie initiatie elementen te beoordelen zonder tussenkomst van nieuw getranscribeerde mRNA of transfectie efficiëntie problemen vaak optreedt bij eukaryotic cel studies.
Hier wordt een protocol opgesteld waarin eIF4G1 mutant mRNA's micro-injectie in Xenopus laevis oocyten De vertaling van maternale mRNA getest. In de aanwezigheid van een defect in GVBD progressie, MOS mRNA polyadenylatie die essentieel is voor voortgang door de oöcyt meiose celcyclus en de daaropvolgende omzetting van de vroege en late klasse mRNA wordt vastgesteld. De fosforylatie Aurora A / EG2 en ERK is eveneens bestudeerd om de gevolgen van mos deregulation.Thus bevestigen Xenopus oöcyten vormen een eenvoudige manier om verschillende stappen van mRNA translatie te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vertaling is een mechanisme betrokken bij de pathofysiologie van talrijke humane ziekten waaronder verscheidene neurodegeneratieve ziekten. Bijvoorbeeld in de ziekte van Parkinson verschillende rapporten stelde de bijzondere waardevermindering in de vertaling in verband met erfelijke mutaties 8,12,13.
Verschillende cellulaire modellen zijn beschikbaar voor taalstudie. Hier, teneinde de translatie gevolgen van een mutatie in eIF4G1 dat als dominant negatieve mutatie verminderen van…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2., Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson’s disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
