Xenopus Laevis как модель для идентификации перевода Обесценение
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
Синтез белка является фундаментальным процессом в экспрессии генов влияющих различные биологические процессы особенно адаптации к условиям окружающей среды. Шаг инициация, которая включает в себя сборку рибосомных субъединиц на мРНК кодон инициации, участвующих фактором инициации в том числе eIF4G1. Дефекты в этом ограничение скорости шага перевода связаны с различными нарушениями. Для изучения возможных последствий таких дерегулирования, Xenopus ооциты Laevis составляют привлекательную модель с высокой степенью сохранения существенных клеточных и молекулярных механизмов с человека. Кроме того, во время мейоза созревания ооциты транскрипционно подавляются и все необходимые белки из ранее существовавших переведены, по материнской линии, полученных мРНК. Это недорогая модель позволяет экзогенный мРНК, чтобы стать совершенно интегрированный с эффективной трансляции. Здесь описан протокол для оценки перевод с коэффициентом интерес (здесь, eIF4G1) с помощью STORред материнской мРНК, которые в первую очередь Полиаденилированную и переведены во созревания ооцитов как физиологического состояния. Во-первых, мРНК синтезируются транскрипцией в пробирке плазмид интереса (здесь eIF4G1) вводят в ооцитах и кинетики созревания ооцитов по зародышевого пузырька обнаружения пробоя определяется. Исследуемый материнской мРНК-мишени является серин / треонин-киназы белка мес. Его полиаденилирования и его последующее перевода исследованы вместе с выражением и фосфорилирования белков МОП каскад участвует в созревании ооцитов сигнализации. Вариации текущего протокола выдвинуть трансляционные дефекты также предложил, чтобы подчеркнуть свою общую применимость. В свете новых доказательств того, что аберрантная синтез белка могут быть вовлечены в патогенез неврологических расстройств, такая модель дает возможность легко оценить эту нарушения и определить новые цели.
Introduction
Белки являются важнейшими элементами клеточной жизни и, таким образом, в более масштабных организма. Они обеспечивают большинство клеточных функций, включая структуры, транспорта, реакции катализа, регулирования, экспрессии генов и т.д. Их выражение является результатом сложного механизма перевода, позволяющего преобразование мРНК в белок. Перевод подвергается различных элементов управления, чтобы адаптироваться и регулировать экспрессию генов в соответствии с потребностями клеток, в процессе разработки и дифференциации, старения, физиологических стрессов или патологических проявлений.
Перевод делится на 3 фазы (инициация, удлинение и прекращение) и подарками 3 системы инициирования перевода для того, чтобы реагировать на эти потребности: крышка-зависимой, крышка независимый помощью вхождения рибосом сегмента (IRES) структур и кэп-независимый Усилители перевода ( САЙТ).
Большинство эукариотических мРНК переводится в кепке-депеОтступ образом через 7-methylguanosine 5'-трифосфата колпачком, который служит в качестве признака распознавания в процессе синтеза белка. Этот колпачок связывается с eIF4E, компонент eIF4F комплексе с eIF4G1 и eIF4A. Связанное с другими партнерами, такими как поли (А) белок, связывающий (PABP), eIF2-ГТФ-Met-тРНК Met, эти факторы инициации трансляции позволяют рассылать циркуляры мРНК и не улучшить доступность форм 43S комплекс до начала AUG-кодона признания 1. Это событие соответствует концу инициации трансляции т.е. на первой стадии перевода.
Кап-независимый перевод используется мРНК, кодирующей белки для основных при стрессовых условиях, которые вызывают пролиферации экземпляр и апоптоза клеток. Этот механизм включает в себя вторичные структуры в мРНК 5'нетранслируемой области (UTR) называется IRES, конец карбокси-конец, связанный с eIF4G1 eIF4A и комплекса 43S. Связывание этого 43S предварительно инициации Complex для IRES инициирует колпачок независимый перевод без необходимости фактора eIF4E 2,3.
Наконец, еще один механизм перевода до сих пор не понятны поддерживает этот шапка-независимый переводческой деятельности при стрессовых условиях с помощью САЙТ структуры, расположенные в мРНК УТР 4.
С помощью этих различных режимах, отличающихся перевод их шагов инициирования, перевод играет важную роль в клеточном гомеостазе и любое изменение в одном из этих процессов, таким образом, повлиять на организм малых и больших эффектов масштаба. В самом деле, начало является ограничение скорости шаг руководящим правильные процессы трансляции мРНК в белки и, таким образом, цель многочисленным управления и точек регулирования 5. Является ли это для него или для компонентов этих процессов, если один оказывается дефектным, он будет нарушать сложившийся баланс в клетке и, таким образом, может привести к патологическим кондиционции. В этом контексте, мутации в факторов перевода были вовлечены в нескольких заболеваний, включая нейродегенеративных расстройств, таких как `лейкоэнцефалопатии с нулевыми белого matter' (eIF2B1-5 субъединицы) 6, при синдроме Уолкотт-Rallison (EIF2AK3 ген, кодирующий для PERK) 7, потенциально болезнь Паркинсона (eIF4G1 p.R1205H) 8. Поэтому важно, чтобы провести клеточные и молекулярные исследования мутантных белков, чтобы увеличить наши знания о развитии болезни и на общем процессе инициации трансляции.
Для проведения этих исследований, важно, чтобы выбрать наиболее адекватные модели для наблюдать последствия этих мутаций у Xenopus Laevis ооциты особенно хорошо приспособлен из-за их физиологических и биохимических свойств:. Физиологическая синхронность (заблокирован в фазе G2 клеточного цикла) , высокая производительность синтеза белка (200-400 нг / день / ооцитов), большое количество добываемой МНКytes из того же животного (800-1000 ооциты / женские) и размер ячейки (1,2-1,4 мм в диаметре), что облегчает их манипуляций. Микроинъекция Xenopus ооцитах с синтезированной мРНК может быть легко выполнена рассекать шаги по переводу. С этой точки зрения она представляет другие преимущества. Учитывая скорость прогрессирования мейоза и перевода после микроинъекции мРНК (~ 24 ч), Xenopus ооцитов представляет собой систему быстрой по сравнению с восстановленным сотовых систем (извлеченных из E.coli, зародышей пшеницы или ретикулоцитов кролика …), в котором мРНК переводится с пониженной скорости перевода и при более низкой скорости. Таким образом, эффекты мутации, введенной в мРНК будет быстро и легко наблюдаемой изучали в нескольких ооцитов. Еще одно преимущество Xenopus ооцитах, что материнских мРНК скрыты и перевод белок заблокированы до прогестерона стимуляции. Добавление прогестерона, таким образом, является хорошим средством контроля индукции перевода. Цитоплазма рolyadenylation не происходит во время оогенеза. Она начинается во время созревания ооцитов прогестерона стимулированных яйцеклеток в временном порядке и продолжается в течение раннего развития и может быть использован для изучения различных этапов перевода.
Полиаденилирования МО мРНК является одним из первых, происходит и принадлежит с Aurora A / EG2, гистонов-Like B4 мРНК к классу "раннее созревание» генов, как определено в Charlesworth и др. (2004) 9. Поступательное индукция "поздних" мРНК, таких как циклин A1 и B1 Cyclin происходит вокруг время зародышевого пузырька пробоя (GVBD). Мос мРНК кодирует серин / треонин киназы-белка. Его перевод имеет решающее значение, так как это вызывает МАР-киназы каскад, который косвенно активирует созревание ооцитов. В самом деле, в ответ на прогестерон, полиаденилирование МО мРНК усиливается с помощью процесса, включающего Aurora A / Eg2 регуляторные белки и другие РНК-связывающие белки с ме 3'UTR МО мРНК. Это увеличение полиаденилирования МОП мРНК приводит к увеличению уровня МОП белка, который в свою очередь активирует MEK1. Этот процесс опосредует активацию внеклеточной сигнальной киназы-2 регулируется (ERK2) (рисунок 1). Это сигнальный каскад может вызвать созревание M-фазу факторов, способствующих, комплекс, образованный циклин B и Cdc2 киназы, и в конечном итоге приводит к возобновлению мейоза.
Поэтому в Xenopus ооциты Laevis, исследование материнских мРНК, таких как MOS может быть легко использован для тестирования их переводимости с несколькими конечными точками от их эффективного полиаденилирования для перевода нескольких мес сигнализации компонентов, в том числе и определение скорости GVBD. Эта система, следовательно, интересно оценить первые последствия мутаций в факторах инициации трансляции без помех вновь транскрипции мРНК или эффективность трансфекции, проблемы часто происходят с eukaryушные исследования клеток.
Вот протокол устанавливается в случаях мутантные eIF4G1 мРНК микроинъекций в ооциты Xenopus Laevis и перевод материнской мРНК проверяется. В присутствии дефекта в прогрессии GVBD МОП мРНК полиаденилирования, которая является существенным для прогрессии через ооцитов мейоза клеточного цикла и последующего перевода ранних и поздних мРНК класса Установлено. Фосфорилирование Aurora A / Eg2 и ЭРК также изучал, чтобы подтвердить следствие МО deregulation.Thus, Xenopus ооциты представляют собой простой способ для анализа различные этапы трансляции мРНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Перевод представляет собой механизм участвует в физиопатологии многочисленных заболеваний у человека и в том числе несколько нейродегенеративных заболеваний. Например, в болезни Паркинсона несколько докладов предложил обесценение в переводе, связанные с наследственными мутациями …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2., Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson’s disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
