대한 바이러스 성 매개 라벨링 및 내측 신경절 예하의 이식 (MGE) 세포<em> 생체</em> 연구
Summary
GABA 성 대뇌 피질의 interneuron 전구 세포는 이식 후 호스트 피질에 통합 시냅스 개발하고, 분산. 이 세포는 쉽게 유전자 변형 GABA 성 전구 물질의 생체 내 연구에 이식하기 전에 형질 도입 할 수있다. 여기서 우리는 기존 Cre 호텔 라인과 Cre 호텔 의존 기자를 사용하여 특정 interneuron 하위 그룹을 대상으로 바이러스 성 라벨링 기술을 보여줍니다.
Abstract
배아 중간과 꼬리 신경절 eminences (MGE과 CGE)에서 파생 된 GABA 성 대뇌 피질의 interneurons는 기능과 형태 학적으로 다양하다. 진출 별개 피질 interneuron 서브 그룹의 역할 이해를 만들어왔다 그러나, GABA 성 세포의 다른 유형의 발달 및 성숙에 기여할 수 손볼 여전히 많은 메커니즘이있다. 또한, 변경 GABA 성 신호는 자폐증, 정신 분열증과 간질의 표현형에 기여할 수있다. 특정 치운다 드라이버 라인은 고유 interneuron 서브 그룹의 기능을 소포 시작했다. 마우스 모델에서의 발전에도 불구하고, 효율적으로 생체 분자 접근법 GABA 성 피질 interneuron 전구 세포를 연구하기가 어렵다. 이러한 세포의 세포 자율적 인 프로그램을 연구하는 데 중요한 기술은 호스트 피질에 MGE 세포의 이식이다. 이 이식 된 세포는 분화, 광범위하게 마이그레이션,차 기능적으로 통합 할 수 있습니다. 또한, MGE 세포를 효율적으로 접근 분자의 다수를 허용 이식 직전 렌티 바이러스 형질 도입 될 수있다. 여기서 사용할 치운다 드라이버 라인과 치운다 의존성 발현 벡터를 사용하여, 세부를 효율적으로 생체 내 이식 분석 전에 MGE 세포를 형질 도입하는데 사용되는 프로토콜 우리. 이 생체 내에서 크 셀형 특정 해상도를 허용하는, 이식 후 세포를 분산시키는 이들의 능력과 정확한 유전자 조작을 결합 때문에이 방법은 바람직하다.
Introduction
나머지는, 글루탐산 주요 신경 세포를 흥분에 해당하는 동안 GABA 성 대뇌 피질의 interneurons는 포유류의 신피질에 신경 ~ 20 ~ 30 %를 포함한다. 의 interneurons는 전기 생리 학적 특성, 축삭과 수상 돌기의 형태와 1을 대상으로 시냅스 매우 다양하고, 흥분성 / 억제 톤의 불균형은 자폐증, 정신 분열증과 간질이 포함 신경 / 신경 정신 질환의 일부 표현형의 기초가 가설된다. 본원에 기술 된 프로토콜의 전반적인 목적은 효율적으로 유전자 분석을위한 생체 내 이식 전에 GABA 성 피질 interneuron 전구 세포를 수정하는 수단을 제공하는 것이다.
대뇌 피질의 GABA 성에서의 interneurons는 중간과 꼬리 신경절 eminences (MGE 각각 CGE) 3,4뿐만 아니라 전핵 지역 5 태어난다. 두피 interneuron 전구 세포는 장거리 접선 마이그레이션이 다음 받다방사형 마이그레이션에 의해 최종 목표에 도달. 목적지에 도착하면,이 대뇌 피질의 interneurons 올바르게 기존의 신경 네트워크에 통합해야하며, 각각의 고유 interneuron 하위 그룹은 특정 방법으로 대뇌 피질의 회로에 기여할 것이다. 네 가지 주요 하위 그룹은 분자 마커에 의해 구별 할 수 있습니다 MGE 파생 소마토스타틴 (SST) + 및 parvalbumin (PV) + 서브 그룹 및 CGE 유래 혈관 활성 장 펩티드 (VIP) + 및 Reelin +; SST – 하위 그룹 6. 다른 대뇌 피질의 interneuron 하위 그룹이 MGE과 CGE 7, 8 배아 개발하는 동안 서로 다른 시간에 걸쳐 태어난다. 이들과 다른 대뇌 피질의 GABA 성을 interneuron 마커는 이러한 하위 그룹 9-11의 많은 특정 Cre 호텔 드라이버 라인을 생성하는 데 사용되었다.
MGE 전구 세포의 이식은 불균형으로 인해 발생할 수 있습니다 질환을 치료하는 잠재적 인 세포 기반 치료로 떠오르고있다24 – 12 여기 / 억제한다. 이 치료 혜택이 많은 근교 체세포 억제 PV + 세포가 MGE에서 파생 된 (차별화와 호스트 뇌에 통합, 분산), 또는 잠재적으로 있기 때문에 MGE 전구 세포의 고유 기능에 부분적으로 기인 할 수있다. MGE 세포는 시험관 내에서 유 전적으로 변형되어 생체 내에서 세포를 연구 할 수 있도록 신속하고 효율적으로 이식하기 전에 15 렌티 바이러스 형질 도입 될 수있다. 이 방법을 개발하기위한 이론적 근거는 GABA 성 피질 interneuron 개발 및 성숙을 연구하는 장애물을 극복하고자 하였다. 특히, MGE 이식 돌연변이 마우스가 다른 방법으로는 초기 시점에서 사망 할 때 연구팀은 생체 내에서 돌연변이 세포의 개발을 연구 할 수 있었다. 더욱이, 이식 전에 관심 유전자를 도입함으로써, 변이 표현형 특정 유전자의 효과 EFF에서 평가 될 수있다icient 방법.
여기서는 이식 이전에 렌티 MGE 세포를 형질 도입하기 상세한 프로토콜을 제공한다. 또한, 우리는이 기술 치운다 의존성 발현 렌티 가능한 치운다 드라이버 마우스 라인의 조합을 사용하여, 피질 interneuron 전구체의 이종 그룹에서 특정 interneuron 서브 그룹에서 관심 유전자를 발현하도록 적응 될 수있는 방법을 보여준다. 유 전적으로 독특한 방식으로 생체 내 연구 GABA 성 대뇌 피질의 interneuron 전구체를 수정하려면 또한,이 프로토콜은 기술과 연구자를위한 플랫폼을 소개합니다. 다른 현재의 접근법을 통해이 기술의 장점은 세포 이식 MGE 멀리 주사 부위에서 분산시키는 것이다. 또한, 초점 바이러스 주사와는 달리, MGE 세포가 분산 후 자신의 형태는 평가하기가 쉽습니다. 이 접근법은 특정 세포 유형을 도입, 돌연변이 또는 야생형 세포에 목적 유전자를 도입의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다기자는 생체 내에서 질병 대립 유전자의 효과를 연구하기 위해 잠재적 형태를 평가, 또는합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포 기반 치료를위한 배아 신경절 eminences (GE 나)에서 GABA 성 대뇌 피질의 interneuron 전구체의 사용은 많은 조건 (12) -1 4 약속을 보이고있다. 정확한 분자 기법을 추적하고, 특정 interneuron 하위 그룹에 대한 관심의 유전자를 표현하기 위해 필요하다. 여기에서 우리는 이식하기 전에 렌티 바이러스로 배아 MGE 세포를 라벨에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고이 기술은 생체 분석을위한 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에서 JLRR하는 보조금에 의해 지원되었다 : 자폐증은 언어, 니나 아일랜드, 웨스턴 항구 '재단, NIMH R01 MH081880 및 NIMH R37 MH049428을. PRW는 대만의 국립 과학위원회에서 친교에 의해 지원되었다. SFS는 F32 (MH103003)에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 gauge needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | n.a. | made in house | |
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | n.a. | Any drug store or pharmacy | |
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
Referências
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