Étiquetage et à médiation virale transplantation de Medial ganglionnaire Eminence (MGE) Cellules pour<em> In Vivo</em> Études
Summary
GABAergiques progéniteurs des interneurones corticaux dispersent, développer et synaptique intégrer dans un cortex hôte après la transplantation. Ces cellules peuvent être facilement transduites avant la transplantation pour les études in vivo de précurseurs GABAergiques génétiquement modifiés. Ici, nous montrons les techniques de marquage viraux pour cibler des sous-groupes de interneurones spécifiques utilisant des lignes existantes et les journalistes Cre Cre-dépendantes.
Abstract
GABAergiques interneurones corticaux, provenant de la médiane embryonnaire et éminences ganglionnaires caudale (MGE et CGE), sont fonctionnellement et morphologiquement diversifié. Incursions ont été réalisés dans la compréhension des rôles des différents sous-groupes de interneurones corticaux, cependant, il ya encore de nombreux mécanismes pour être élaborés qui peuvent contribuer au développement et à la maturation des différents types de cellules GABAergiques. De plus, la signalisation GABAergique modifié peut contribuer à des phénotypes de l'autisme, la schizophrénie et l'épilepsie. Lignes Cre-pilote spécifique ont commencé à morceler les fonctions de sous-groupes de interneurones uniques. Malgré les progrès réalisés dans des modèles de souris, il est souvent difficile d'étudier efficacement des interneurones GABAergiques progéniteurs corticale avec des approches moléculaires in vivo. Une technique importante utilisée pour étudier la programmation autonome des cellules de ces cellules est une transplantation de cellules dans le cortex MGE hôtes. Ces cellules transplantées migrent largement, différencier, une intégrer fonctionnellement. En outre, les cellules peuvent être efficacement MGE transduites avec des lentivirus immédiatement avant la transplantation, ce qui permet une multitude d'approches moléculaires. Ici, nous en détail un protocole de transduire efficacement des cellules MGE avant la transplantation pour l'analyse in vivo, en utilisant des lignes disponibles Cre-conducteur et des vecteurs d'expression Cre-dépendantes. Cette approche est avantageuse car elle combine la manipulation génétique précise de la capacité de ces cellules à se disperser après la transplantation, ce qui permet une plus grande résolution spécifique de type cellulaire in vivo.
Introduction
GABAergiques interneurones corticaux comprennent ~ 20-30% de neurones dans le néocortex des mammifères, tandis que le reste correspond aux neurones excitateurs principaux glutamatergiques. Interneurones sont très diverses dans les propriétés électrophysiologiques, axone et la morphologie des dendrites et synaptique ciblage 1, et les déséquilibres dans le ton excitateur / inhibitrice sont émis l'hypothèse à la base des phénotypes de troubles neuropsychiatriques / neurologiques, y compris l'autisme, la schizophrénie et l'épilepsie 2. L'objectif global du protocole décrit ici est de fournir un moyen de modifier efficacement génétiquement GABAergiques progéniteurs des interneurones corticaux avant la transplantation in vivo analyses.
Interneurones corticaux GABAergiques sont nés dans les éminences ganglionnaires médial et caudal (MGE et CGE, respectivement) 3,4 ainsi que l'aire préoptique 5. Progéniteurs des interneurones corticaux subissent longue distance la migration tangentielle suiviepar la migration radiale pour atteindre leurs objectifs finaux. À l'arrivée à leur destination, ces interneurones corticaux doivent intégrer correctement dans le réseau neuronal existant, et chaque sous-groupe de interneurone uniques contribueront à circuit cortical de manière spécifique. Quatre sous-groupes principaux peuvent être distingués par marqueurs moléculaires: la somatostatine MGE dérivés (SST) + et parvalbumine (PV) + sous-groupes, et le peptide dérivé CGE-intestinal vasoactif (VIP) + et + Reelin; SST – 6 sous-groupes. Différents sous-groupes des interneurones corticaux sont nés au cours des moments différents au cours du développement embryonnaire dans la CGE et MGE 7, 8. Ceux-ci et d'autres marqueurs corticales d'interneurones GABAergiques ont été utilisées pour générer des lignées Cre-pilote spécifique pour bon nombre de ces sous-groupes 9-11.
La transplantation de progéniteurs de MGE a émergé comme une thérapie à base de cellules potentiel pour traiter les troubles qui peuvent être causés par des déséquilibresdans l'excitation / inhibition 12-24. Ces avantages thérapeutiques peuvent être dues en partie à la capacité unique de progéniteurs de MGE (pour disperser, de se différencier et de se intégrer dans un cerveau de l'hôte), ou potentiellement parce que beaucoup de péri-somatiques PV inhibitrice + cellules sont dérivées de la MGE. MGE cellules peuvent également être rapidement et efficacement transduction avec lentivirus avant la transplantation 15, permettant aux cellules qui sont génétiquement modifiées in vitro pour être étudiées in vivo. La justification de l'élaboration de cette approche était de surmonter les obstacles à l'étude GABAergique développement des interneurones corticaux et la maturation. En particulier, MGE transplantation a permis aux chercheurs d'étudier le développement de cellules mutantes in vivo, lorsque la souris mutante aurait autrement mort à un point de contrôle d'avance. En outre, par l'introduction de gènes d'intérêt avant la transplantation, les effets de gènes spécifiques d'un phénotype mutant ont pu être évalués dans un effmanière isant.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la transduction de cellules MGE avec lentivirus avant la transplantation. En outre, nous montrons comment cette technique peut être adaptée pour exprimer un gène d'intérêt dans les sous-groupes des interneurones spécifiques dans un groupe hétérogène de précurseurs des interneurones corticaux, en utilisant une combinaison de lentivirus d'expression Cre-dépendantes et des lignées de souris Cre-pilote disponibles. En outre, ce protocole introduit des techniques et une plateforme pour les chercheurs à modifier génétiquement des interneurones GABAergiques précurseurs corticale pour les études in vivo d'une manière unique. Un avantage de cette technique par rapport à d'autres approches actuelles est que les cellules transplantées MGE se disperser à distance du site d'injection. Aussi, contrairement à injections virales focaux, après que les cellules de MGE dispersent leur morphologie est plus facile à évaluer. Cette approche peut être utilisée pour étudier l'effet de l'introduction de gènes d'intérêt dans le type sauvage ou cellules mutantes, l'introduction d'un type de cellule spécifiquereporter pour évaluer la morphologie, ou potentiellement pour étudier l'effet d'allèles pathologiques in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'utilisation de précurseurs des interneurones GABAergiques corticale des éminences ganglionnaires embryonnaires (GES) pour les thérapies à base de cellules est prometteuse pour de nombreuses affections 12 -1 4. Techniques moléculaires précises sont nécessaires pour suivre et exprimer des gènes d'intérêt dans les sous-groupes des interneurones spécifiques. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour le marquage des cellules embryonnaires MGE avec lentivirus avant la transplantation e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des subventions à JLRR de: Autism Speaks, Nina Irlande, Weston Havens Fondation, NIMH R01 MH081880 et NIMH R37 MH049428. PRW a été soutenue par une bourse de la National Science Council de Taiwan. SFS a été soutenu par F32 (MH103003).
Materials
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 gauge needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | n.a. | made in house | |
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | n.a. | Any drug store or pharmacy | |
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
Referências
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