के लिए वायरल की मध्यस्थता लेबल और औसत दर्जे का ganglionic श्रेष्ठता का ट्रांसप्लांटेशन MGE () प्रकोष्ठों<em> Vivo</em> अध्ययन
Summary
GABAergic कॉर्टिकल interneuron पूर्वज प्रत्यारोपण के बाद एक मेजबान के कोर्टेक्स में एकीकृत synaptically को विकसित करने और फैलाने। इन कोशिकाओं को आसानी से आनुवंशिक रूप से संशोधित GABAergic व्यापारियों के vivo अध्ययन के लिए प्रत्यारोपण से पहले transduced किया जा सकता है। यहाँ, हम मौजूदा Cre लाइनों और रचनात्मक निर्भर संवाददाताओं का उपयोग कर विशिष्ट interneuron उपसमूहों लक्षित करने के लिए वायरल लेबलिंग तकनीक दिखा।
Abstract
भ्रूण औसत दर्जे का है और दुम ganglionic eminences MGE (और CGE) से ली गई GABAergic कॉर्टिकल interneurons, कार्यात्मक और आकृति विज्ञान के विविध रहे हैं। पैठ अलग कॉर्टिकल interneuron उपसमूहों की भूमिका को समझने में किया गया है, हालांकि, GABAergic कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के विकास और परिपक्वता के लिए योगदान कर सकते हैं कि बाहर काम किया जाना अभी भी कई यांत्रिकी हैं। इसके अलावा, बदल GABAergic संकेतन आत्मकेंद्रित, एक प्रकार का पागलपन और मिरगी के phenotypes के लिए योगदान कर सकते हैं। विशिष्ट रचनात्मक-चालक लाइनों अद्वितीय interneuron उपसमूहों के कार्यों बाहर पार्सल करने के लिए शुरू कर दिया है। माउस मॉडल के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, यह कुशलतापूर्वक विवो में आणविक दृष्टिकोण के साथ GABAergic कॉर्टिकल interneuron progenitors अध्ययन करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है। इन कोशिकाओं के सेल स्वायत्त प्रोग्रामिंग का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक महत्वपूर्ण तकनीक मेजबान cortices में MGE कोशिकाओं के प्रत्यारोपण है। ये प्रतिरोपित कोशिकाओं को अलग, बड़े पैमाने पर विस्थापित, एकएन डी कार्यात्मक एकीकृत। इसके अलावा, MGE कोशिकाओं कुशलतापूर्वक आणविक दृष्टिकोण की एक भीड़ के लिए अनुमति देता है, प्रत्यारोपण के लिए तुरंत पहले lentivirus के साथ transduced किया जा सकता है। यहाँ उपलब्ध Cre-चालक लाइनों और रचनात्मक निर्भर अभिव्यक्ति वैक्टर का उपयोग, विस्तार कुशलता में विवो विश्लेषण के लिए प्रत्यारोपण से पहले MGE कोशिकाओं transduce करने के लिए एक प्रोटोकॉल हम। यह विवो में अधिक से अधिक सेल प्रकार विशिष्ट संकल्प अनुमति प्रत्यारोपण के बाद फैलाने के लिए इन कोशिकाओं की क्षमता के साथ सटीक आनुवंशिक हेरफेर को जोड़ती है, क्योंकि यह दृष्टिकोण लाभदायक है।
Introduction
बाकी, glutamatergic प्रिंसिपल न्यूरॉन्स उत्तेजक के अनुरूप जबकि GABAergic कॉर्टिकल interneurons, स्तनधारी neocortex में न्यूरॉन्स की ~ 20-30% शामिल। Interneurons electrophysiological गुण, अक्षतंतु और dendrite आकृति विज्ञान और एक लक्षित कर अन्तर्ग्रथनी में अत्यधिक विविध रहे हैं, और उत्तेजक / निरोधात्मक स्वर में असंतुलन आत्मकेंद्रित, एक प्रकार का पागलपन और मिरगी 2 सहित न्यूरोलॉजिकल / neuropsychiatric विकारों के कुछ फेनोटाइप आबाद करने के लिए धारणा कर रहे हैं। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य कुशलता से आनुवंशिक रूप से इन विवो विश्लेषण के लिए प्रत्यारोपण से पहले GABAergic कॉर्टिकल interneuron पूर्वज संशोधित करने के लिए एक साधन प्रदान करना है।
Cortical GABAergic interneurons औसत दर्जे का है और दुम ganglionic eminences MGE (और क्रमशः CGE) 3,4 और साथ ही preoptic क्षेत्र 5 में पैदा होते हैं। Cortical interneuron पूर्वज लंबी दूरी की स्पर्शरेखा प्रवास पीछा से गुजरनारेडियल प्रवास करके अपने अंतिम लक्ष्य तक पहुँचने के लिए। उनके गंतव्यों में आगमन पर, इन कॉर्टिकल interneurons सही ढंग से मौजूदा neuronal नेटवर्क में एकीकृत करना चाहिए, और प्रत्येक अद्वितीय interneuron उपसमूह विशिष्ट तरीके में cortical circuitry के लिए योगदान देगा। चार मुख्य उपसमूहों आणविक मार्कर द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है: MGE व्युत्पन्न सोमेटोस्टैटिन (एसएसटी) + और parvalbumin (पीवी) + उपसमूहों, और CGE व्युत्पन्न vasoactive आंतों पेप्टाइड (वीआईपी) + और Reelin +; एसएसटी – उपसमूहों 6। विभिन्न कॉर्टिकल interneuron उपसमूहों MGE और CGE 7, 8 में भ्रूण के विकास के दौरान अलग से अधिक बार पैदा होते हैं। ये और अन्य कॉर्टिकल GABAergic interneuron मार्करों इन उपसमूहों 9-11 से कई के लिए विशिष्ट रचनात्मक-चालक लाइनों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
MGE progenitors के प्रत्यारोपण के असंतुलन की वजह से हो सकता है कि विकारों के इलाज के लिए एक संभावित सेल आधारित चिकित्सा के रूप में उभरा है12-24 / उत्तेजना निषेध में। ये चिकित्सीय लाभ कई पेरी-दैहिक निरोधात्मक पीवी + कोशिकाओं MGE से निकाली गई है (अंतर और एक मेजबान के मस्तिष्क में एकीकृत, फैलाने के लिए), या संभवतः क्योंकि MGE progenitors के अद्वितीय क्षमता के कारण भाग में हो सकता है। MGE कोशिकाओं को भी आनुवंशिक रूप से इन विट्रो में संशोधित कर रहे हैं कि कोशिकाओं vivo में अध्ययन किया जा करने के लिए अनुमति देता है, जल्दी से और कुशलता प्रत्यारोपण 15 से पहले lentiviruses साथ transduced किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण को विकसित करने के लिए तर्क GABAergic कॉर्टिकल interneuron विकास और परिपक्वता का अध्ययन करने में बाधाओं पर काबू पाने के लिए किया गया था। विशेष रूप से, MGE प्रत्यारोपण उत्परिवर्ती माउस अन्यथा एक प्रारंभिक समय बिंदु पर मर गया होगा जब शोधकर्ताओं विवो में उत्परिवर्ती कोशिकाओं के विकास का अध्ययन करने की अनुमति दी। इसके अलावा, प्रत्यारोपण से पहले ब्याज की जीन शुरू करने से, एक उत्परिवर्ती phenotype पर विशिष्ट जीन का प्रभाव एक eff में मूल्यांकन किया जा सकता हैicient तरीके से।
यहाँ, हम प्रत्यारोपण करने से पहले lentiviruses साथ MGE कोशिकाओं transduce करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके अलावा, हम इस तकनीक Cre निर्भर अभिव्यक्ति lentiviruses और उपलब्ध Cre-चालक माउस लाइनों के संयोजन का उपयोग, कोर्टिकल interneuron व्यापारियों का एक विषम समूह से विशिष्ट interneuron उपसमूहों में ब्याज की एक जीन व्यक्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे दिखा। आनुवंशिक रूप से एक अनोखा तरीका में vivo अध्ययन के लिए GABAergic कॉर्टिकल interneuron व्यापारियों को संशोधित करने के लिए इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल तकनीक और शोधकर्ताओं के लिए एक मंच का परिचय। अन्य वर्तमान दृष्टिकोण पर इस तकनीक का एक फायदा प्रत्यारोपित MGE कोशिकाओं दूर इंजेक्शन साइट से फैलाने जाएगा। इसके अलावा, फोकल वायरल इंजेक्शन के विपरीत, MGE कोशिकाओं को फैलाने के बाद उनकी आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए आसान है। यह दृष्टिकोण विशिष्ट एक सेल प्रकार शुरू करने, जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती कोशिकाओं में ब्याज की जीन शुरू करने के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसंवाददाता विवो में रोग एलील के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संभावित आकृति विज्ञान का आकलन, या करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल आधारित चिकित्सा के लिए भ्रूण ganglionic eminences (GES) से GABAergic कॉर्टिकल interneuron व्यापारियों का उपयोग कई स्थितियों 12 -1 4 के लिए वादा दिखा रहा है। सटीक आणविक तकनीक पर नज़र रखने के लिए, और विशिष्ट interneuron उपसमूहों में ब्य?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम से JLRR को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया: आत्मकेंद्रित बोलती, नीना आयरलैंड, वेस्टन वाले देश फाउंडेशन, NiMH R01 MH081880, और एच R37 MH049428। PRW ताइवान की राष्ट्रीय विज्ञान परिषद से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। एसएफएस F32 (MH103003) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 gauge needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | n.a. | made in house | |
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | n.a. | Any drug store or pharmacy | |
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
Referências
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