قياس مقاومة الاكسدة من<em> انواع معينة ايليجانس</em> في 96-جيدا لوحات عيار مكروي
Summary
C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.
Abstract
الاكسدة، الذي هو نتيجة لاختلال التوازن بين الإنتاج وإزالة السموم من أنواع الاكسجين التفاعلية، هو المساهم الرئيسي في اضطرابات البشرية المزمنة، بما في ذلك القلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية، ومرض السكري، والشيخوخة، والسرطان. وبالتالي، فمن المهم دراسة الاكسدة ليس فقط في الأنظمة الخلية ولكن أيضا باستخدام الكائنات كلها. C. ايليجانس هو كائن نموذجا جذابا لدراسة علم الوراثة من المؤكسدة مسارات نقل الإشارة الإجهاد، والتي يتم حفظها للغاية من الناحية التطورية.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول لقياس مقاومة الاكسدة في C. ايليجانس في السائل. تذاب لفترة وجيزة، ROS الذي يحفز الكواشف مثل الباراكوات (PQ) وH 2 O 2 في المخزن M9، وaliquoted الحلول في الآبار لوحة microtiter 96 أيضا. L4 متزامنة / الشباب البالغين C. يتم نقل الحيوانات ايليجانس إلى الآبار (5-8 الحيوانات / جيد) ويتم قياس البقاء على قيد الحياةكل ساعة حتى معظم الديدان قد لقوا حتفهم. عند إجراء مقاومة الاكسدة فحص باستخدام تركيز منخفض من الضغوطات في لوحات، والشيخوخة قد تؤثر على سلوك الحيوانات على الاكسدة، والتي يمكن أن تؤدي إلى تفسير غير صحيح من البيانات. ومع ذلك، في مقايسة الموصوفة هنا، هذه المشكلة غير المحتمل أن يحدث منذ تستخدم فقط L4 / حيوانات الشباب البالغين. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول هو غير مكلف ويتم الحصول على نتائج في يوم واحد، مما يجعل هذه التقنية جذابة للشاشات الوراثية. عموما، هذا سوف يساعد على فهم الأكسدة مسارات إشارة التوتر تنبيغ، التي يمكن ترجمتها إلى توصيف أفضل للأكسدة اضطرابات البشرية المرتبطة الإجهاد.
Introduction
في حقيقيات النوى، الفسفرة المؤكسدة التي تجري في سلسلة نقل الإلكترون من الميتوكوندريا هي المحرك الرئيسي لإنتاج الطاقة في شكل ATP. أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) هي نتاج طبيعي لهذه العملية. على الرغم من الدور الهام الذي يقومون به كما يشير الجزيئات، يمكن أن الإفراط ROS تؤدي إلى تلف الحمض النووي والبروتينات كربنلة، وأكسدة الدهون. اختلال التوازن بين الإنتاج ROS وإزالة السموم يسبب الإجهاد التأكسدي، الأمر الذي يؤدي إلى استنزاف الطاقة، وتلف الخلايا، ويؤدي موت الخلايا 1،2. يساهم الإجهاد التأكسدي الشيخوخة وتطوير العديد من الأمراض التي تهدد الحياة بما في ذلك السرطان والسكري والقلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية 3-9.
وقد تطورت الخلايا استراتيجيات الدفاع الأنزيمية وغير الأنزيمية للحفاظ على مستويات ROS المناسبة وحماية ناخبيهم من التلف التأكسدي 1،2. الفائق (الاحمق) الانزيمات تعمل أول من conveRT الفائق إلى H 2 O 2، والتي يتم تحويلها لاحقا إلى المياه عن طريق الكاتلاز أو الانزيمات البيروكسيديز. وتشمل استراتيجيات الدفاع غير الأنزيمية معظمهم من الجزيئات التي تتفاعل بشكل أسرع مع ROS بالمقارنة مع الجزيئات الخلوية، وحماية المكونات الخلوية الأساسية. على الرغم من الدور الوقائي للROS إزالة السموم والإنزيمات، وبعض الجزيئات ROS هربا من آليات الدفاع المضادة للأكسدة، وتؤدي إلى الضرر التأكسدي. كشف وإصلاح، وتدهور المكونات الخلوية التالفة واستراتيجيات الدفاع الأساسية خلال الاكسدة 1،2.
مسارات إشارات تشارك في مقاومة التوتر والإجهاد التأكسدي على وجه التحديد هي موضع الحفظ تطويريا 10،11. على عكس تجارب زراعة الخلية حيث ترد إلا بصورة جزئية الظروف عضوي، ودراسة الاكسدة في الكائنات النموذج 12،13 لها أهمية كبيرة. C. ايليجانس هو الخيطية حرة المعيشة التي يمكن أن تكون بسهولة وبتكلفة زهيدة طريق مسدودبناءه من جديد على العشب البكتيرية على وسائل الإعلام أجار. انها صغيرة في الحجم (حوالي 1 ملم في الطول) وعادة ينمو باعتباره خنثى-التسميد الذاتي، مما يسهل التلاعب الجيني. أنه يحتوي على دورة الحياة السريعة والقدرة على الإنجاب عالية، تنتج نحو 300 ذرية في جيل، مما يجعلها أداة قوية لأداء شاشات الوراثية على نطاق واسع (14). وC. والتسلسل ايليجانس الجينوم بالكامل وتوقع 40-50٪ من الجينات لتكون المتماثلات من الأمراض المرتبطة الجينات البشرية 15-18. ضربة قاضية للجينات ذات الاهتمام باستخدام رني هي سريعة وسهلة في C. ايليجانس. الجيني أسفل اللائحة يمكن أن يتحقق عن طريق تغذية الحيوانات E. البكتيريا القولونية التي تأوي البلازميد معربا عن RNA المزدوج تقطعت بهم السبل التي تستهدف مرنا من الفائدة 19. لذلك، وتحديد وظيفة الجين باستخدام شاشات رني على نطاق واسع له تأثير كبير على فهم الأمراض التي تصيب الإنسان بما في ذلك السرطان 20،21.
دراسات سمقاومة الإجهاد xidative في C. أدت ايليجانس إلى تحديد آليات الحفظ لمقاومة الاكسدة 13،22. بعض المسارات التي تم تحديدها هي مسارات المشتركة التي تعدل طول العمر ومقاومة للضغوط أخرى أيضا مثل نقص الأكسجين والحرارة والضغط الاسموزي. وتشمل هذه المسارات إشارات الأنسولين، TOR الإشارات، والالتهام الذاتي. وتشمل مسارات رئيسية أخرى إزالة السموم من ROS مثل الانزيمات الفائق الفائق والإنزيمات الكاتلاز، أو في إصلاح الأضرار مثل الصدمة الحرارية والبروتينات كوصي 11،13،22.
يصف هذا البروتوكول كيفية تحديد مقاومة الاكسدة من C. ايليجانس في السائل. كنا flcn-1 (ok975) والبرية من نوع الحيوانات للتدليل على البروتوكول منذ أظهرنا سابقا زيادة مقاومة الاكسدة عند فقدان flcn-1 (ok975) في C. ايليجانس 23. لقد أظهرنا أيضا أن هذه المقاومة تعتمد زيادةعلى AMPK والالتهام الذاتي، محور الإشارات التي تعمل على تحسين الطاقة الحيوية الخلوية ويعزز مقاومة الإجهاد 23. PQ هو الإجهاد التأكسدي الذي يتداخل مع سلسلة نقل الإلكترون لإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية 24. ويمكن أن تتكيف نفس الفحص ويمكن استخدام مصادر ROS أخرى أو ROS المركبات توليد مثل H 2 O 2 و روتينون. وقد وضعت فحوصات مماثلة على لوحات التي تستخدم فيها تركيزات منخفضة من PQ 25،26. الاستفادة من هذا الاختبار هو أنه سريع جدا، ويمكن الحصول على النتائج في يوم واحد. بالإضافة إلى ذلك، إجمالي حجم السائل المستخدم لأداء المقاومة الاكسدة فحص في 96 لوحات جيدة منخفضة بالمقارنة مع حجم المستخدمة في إعداد PQ التي تحتوي على لوحات. ولذلك، فإن كمية PQ المستخدمة في فحص السائل منخفضة، مما يجعل فحص غير مكلف ويحد من إنتاج النفايات السامة. ومع ذلك، القيود المفروضة على هذا الاختبار بالمقارنة مع المقايسات لوحة تشمل لاالمسيخ الطعام في فحص السائل وأقل تركيز الأوكسجين في السائل بالمقارنة مع الهواء. هذه هي العوامل الهامة التي في بعض الحالات، قد تؤثر على النتائج. لذلك، مؤكدا استنساخ باستخدام وسائل أخرى للمقاومة الاكسدة ويوصى لدعم النتائج التي تم الحصول عليها في هذا الاختبار.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. ايليجانس هو كائن نموذجا جذابا لدراسة مقاومة الاكسدة في الجسم الحي وراثيا لأنه يمكن أن يكون مثقف بسهولة، ويؤدي إلى عدد كبير من نسل متطابقة وراثيا بسرعة. أساليب متعددة لقياس مقاومة الاكسدة وقد وصفت في وقت سابق، وأنها تستند إلى مكملات لوحات الثقافة مع مختلف …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف مركز علم الوراثة انواع معينة لC. سلالات ايليجانس. وقدمت الدعم المالي من قبل معهد بحوث فوكس تيري. علينا أيضا أن نعترف الدعم الممنوح للEP من Rolande ومارسيل غوسلين العليا Studentship ومنحة التدريب CIHR / FRSQ في FRN53888 أبحاث السرطان من برنامج التدريب أبحاث السرطان ماكجيل المتكاملة.
Materials
| Agar bacteriological grade | Multicell | 800-010-LG | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Sodium chloride biotechnology grade | Bioshop | 7647-14-5 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure tris hydrochloride | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris aminomethane | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicillin | Bioshop | 69-52-3 | |
| Yeast extract | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| Methyl viologen dichloride hydrate | Aldrich chemistry | 856177-1G | |
| Petri dish 60x15mm | Fisher | FB0875713A | |
| Pipet 10ml | Fisher | 1367520 | |
| Potassium phosphate monobasic | G-Biosciences | RC-084 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M-5921 | |
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | |||
| 96 well clear microtiter plate | |||
| flcn-1 RNAi source | Ahringer Library | ||
Referências
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases. Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).
- Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).
- Trushina, E., McMurray, C. T. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neurociência. 145, 1233-1248 (2007).
- Touyz, R. M., Briones, A. M. Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension. Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).
- Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).
- Sosa, V., et al. Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).
- Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).
- Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging. Trends Genet. 29, 367-374 (2013).
- Hope, I. A. . Practical approach series. , 282 (1999).
- C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Ahringer, J. Turn to the worm!. Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).
- Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. Human and nematode orthologs–lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans. Gene. 238, 163-170 (1999).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).
- Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research. Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).
- Moreno-Arriola, E., et al. Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor. Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).
- Possik, E., et al. Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival. PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).
- Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metab. 6, 280-293 (2007).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77, 71-94 (1974).
- Timmons, L. Delivery methods for RNA interference in. C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).
- Wang, B. Y., et al. Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance. Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).
- Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans. PLoS One. 9, 97924 (2014).
- Ward, J. D., et al. Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses. PLoS One. 9, 92552 (2014).
- Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress. PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).
- Greer, E. L., et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in. C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
- Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).
- Apfeld, J., O’Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans. Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).
- Lee, H., et al. The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior. J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).
- Honda, Y., Honda, S. The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).
- Restif, C., Metaxas, D. Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies. Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).
- Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neurosci. 10, 84 (2009).
