Medição de resistência de Estresse Oxidativo<em> Caenorhabditis elegans</em> Em placas de 96 poços de microtitulação
Summary
C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.
Abstract
O stress oxidativo, que é o resultado de um desequilíbrio entre a produção e a desintoxicação de espécies reactivas de oxigénio, é um dos principais contribuintes para doenças humanas crónicas, incluindo doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, diabetes, envelhecimento e cancro. Portanto, é importante para estudar o stress oxidativo, não só em sistemas de células, mas também utilizando organismos inteiros. C. elegans é um organismo modelo atraente para estudar a genética de vias de transdução de sinal de estresse oxidativo, que são altamente conservadas evolutivamente.
Aqui, nós fornecemos um protocolo para medir a resistência ao estresse oxidativo em C. elegans em líquido. Reagentes Resumidamente, ROS-indutores, tais como paraquato (PQ) e H 2 O 2 são dissolvidos em tampão M9, e soluções são aliquotadas em cavidades de uma placa de microtitulação de 96 poços. L4 sincronizado / adulto jovem C. elegans animais são transferidos para os poços (5-8 animais / poço) e é medida a sobrevivênciaa cada hora até que a maioria dos worms estão mortos. Ao realizar um ensaio de resistência ao estresse oxidativo utilizando uma baixa concentração de estressores em placas, o envelhecimento pode influenciar o comportamento dos animais sobre o estresse oxidativo, o que poderia levar a uma interpretação incorrecta dos dados. No entanto, no ensaio aqui descrito, este problema é improvável de ocorrer uma vez que apenas L4 / animais adultos, jovens estão sendo usados. Além disso, este protocolo é barato e resultados são obtidos em um dia, o que torna esta técnica atraente para telas genéticos. No geral, isso irá ajudar a compreender vias de transdução de sinal de estresse oxidativo, que poderia ser traduzido em melhor caracterização de doenças humanas associadas a estresse oxidativo.
Introduction
Em eucariotas, fosforilação oxidativa ocorrendo na cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria é o principal motor da produção de energia na forma de ATP. Espécies reativas de oxigênio (ROS) são um subproduto natural do processo. Apesar do seu importante papel como moléculas de sinalização, excessiva de ROS pode levar a danos no ADN, carbonilação de proteínas, e a oxidação de lípidos. Um desequilíbrio entre a produção de ROS e desintoxicação faz com que o stress oxidativo, o que conduz à depleção da energia, lesão celular, e provoca a morte celular 1,2. O estresse oxidativo contribui para o envelhecimento e para o desenvolvimento de muitas doenças potencialmente fatais, incluindo câncer, diabetes, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas 3-9.
As células desenvolveram estratégias de defesa enzimáticos e não enzimáticos para manter os níveis de ROS adequadas e proteger os seus constituintes contra dano oxidativo 1,2. Superóxido dismutase (SOD) enzimas agem primeiro a convert superóxido a H 2 O 2, que é posteriormente convertida em água pela catalase ou enzimas peroxidase. Estratégias de defesa não enzimáticas incluem principalmente moléculas que reagem mais rapidamente com ROS, em comparação com macromoléculas celulares, protegendo os componentes celulares essenciais. Apesar do papel protetor da ROS desintoxicação enzimas, algumas moléculas ROS escapar dos mecanismos de defesa antioxidante e levar a danos oxidativos. Detecção, reparação e degradação dos componentes celulares danificados são estratégias essenciais da defesa durante o estresse oxidativo 1,2.
Vias de sinalização envolvidas na resistência ao estresse e estresse oxidativo especificamente são altamente evolutivamente conservada 10,11. Ao contrário de experimentos de cultura de células, onde as condições organismal são apenas parcialmente reproduzido, o estudo do estresse oxidativo em organismos modelo 12,13 tem um grande significado. C. elegans é um nematóide de vida livre que pode ser fácil e barata cultured em um gramado bacteriana no meio de ágar. É pequeno no tamanho (cerca de 1 mm de comprimento) e, normalmente, cresce como um hermafrodita auto-fertilizar, o que facilita as manipulações genéticas. Tem um ciclo de vida rápido e uma alta capacidade reprodutiva, produzindo cerca de 300 descendentes por geração, tornando-se uma ferramenta poderosa para executar telas genéticos de larga escala 14. A C. elegans genoma está completamente sequenciado e 40-50% dos genes é previsível que sejam homólogos de genes associados a doenças humanas 15-18. O knockdown de genes de interesse utilizando RNAi é rápida e fácil em C. elegans. Gene para baixo regulamento poderia ser alcançado através da alimentação de animais a E. bactérias coli que abrigam um plasmídeo que expressa o ARN de cadeia dupla que tem como alvo o mRNA de interesse 19. Portanto, a determinação da função do gene usando telas de RNAi em grande escala tem um grande impacto na compreensão das doenças humanas, incluindo câncer 20,21.
Estudos de Oresistência ao estresse xidative em C. elegans levaram à identificação de mecanismos conservadas de resistência ao stress oxidativo 13,22. Algumas vias são identificadas vias comuns que modulam a longevidade e resistência a outros tipos de stress, bem como a hipóxia, calor, e stress osmótico. Estas vias incluem a sinalização de insulina, a sinalização TOR, e autofagia. Outras vias importantes envolvem desintoxicação de ROS como enzimas superóxido dismutase e enzimas catalase, ou na reparação de danos, tais como proteínas de choque térmico e acompanhar 11,13,22.
Este protocolo descreve como para determinar a resistência ao stress oxidativo de C. elegans em líquido. Nós usamos flcn-1 (ok975) e animais de tipo selvagem para demonstrar o protocolo já que mostramos anteriormente um aumento da resistência ao estresse oxidativo após a perda de flcn-1 (ok975) em C. elegans 23. Também mostraram que este aumento da resistência dependeem AMPK e autofagia, um eixo de sinalização que melhora bioenergética celular e promove a resistência ao estresse 23. PQ é um estressor oxidativo que interfere com a cadeia de transporte de elétrons para produzir espécies reativas de oxigênio 24. O mesmo ensaio pode ser adaptado e outras fontes de ROS ou compostos que geram ROS poderia ser utilizado tal como H 2 O 2 e rotenona. Ensaios semelhantes foram desenvolvidas em placas onde as baixas concentrações de PQ são utilizados 25,26. A vantagem deste teste é que ele é muito rápido, e os resultados podem ser obtidos em apenas um dia. Além disso, o volume total de líquido utilizado para realizar o ensaio de resistência ao estresse oxidativo em placas de 96 poços é baixo quando comparado com o volume utilizado para preparar-PQ contendo placas. Portanto, a quantidade de PQ usado é no ensaio de líquido é baixa, o que torna o ensaio pouco dispendioso e limita a produção de resíduos tóxicos. No entanto, limitações deste ensaio em comparação com ensaios em placa incluem o lack de alimento no líquido de ensaio e a menor concentração de oxigénio no líquido, em comparação com o ar. Estes são factores importantes que, em alguns casos, podem influenciar os resultados. Portanto, confirmando a reprodutibilidade utilizando outros métodos de resistência ao estresse oxidativo é recomendado para suportar os resultados obtidos neste ensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans é um organismo modelo atractivo para estudar a resistência ao estresse oxidativo geneticamente in vivo, uma vez que podem ser facilmente cultivadas e rapidamente leva a um grande número de descendentes geneticamente idênticos. Vários métodos para medir a resistência de stress oxidativo têm sido anteriormente descrita e que se baseiam na suplementação de placas de cultura com várias fontes de ROS, como a PQ, rotenona, H 2 O 2, e juglona 25,26,29-32.…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o Centro de Genética Caenorhabditis para C. estirpes elegans. Suporte O financiamento foi fornecido pelo Instituto de Pesquisa Fox Terry. Agradecemos também o apoio concedido à EP da Rolande e Marcel Gosselin Graduate Studentship ea bolsa de formação CIHR / FRSQ em FRN53888 do Programa Integrado de Formação McGill Cancer Research investigação do cancro.
Materials
| Agar bacteriological grade | Multicell | 800-010-LG | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Sodium chloride biotechnology grade | Bioshop | 7647-14-5 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure tris hydrochloride | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris aminomethane | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicillin | Bioshop | 69-52-3 | |
| Yeast extract | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| Methyl viologen dichloride hydrate | Aldrich chemistry | 856177-1G | |
| Petri dish 60x15mm | Fisher | FB0875713A | |
| Pipet 10ml | Fisher | 1367520 | |
| Potassium phosphate monobasic | G-Biosciences | RC-084 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M-5921 | |
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | |||
| 96 well clear microtiter plate | |||
| flcn-1 RNAi source | Ahringer Library | ||
Referências
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