Måling oxidativ stress Modstand af<em> Caenorhabditis elegans</em> I 96-brønds mikrotiterplader
Summary
C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.
Abstract
Oxidativt stress, som er resultatet af en ubalance mellem produktion og afgiftning af reaktive oxygenarter, er en stor bidragyder til kroniske humane lidelser, herunder kardiovaskulær sygdom og neurodegenerative sygdomme, diabetes, ældning, og cancer. Derfor er det vigtigt at studere oxidativt stress ikke kun i cellesystemer men også anvende hele organismer. C. elegans er en attraktiv model organisme for at studere genetik oxidative stress signaltransduktionsveje, som er stærkt evolutionært konserverede.
Her giver vi en protokol til måling af oxidativt stress modstand i C. elegans i væske. Kort fortalt, ROS-inducerende reagenser, såsom paraquat (PQ) og H 2 O 2 opløses i M9 buffer og opløsninger alikvoteres i brøndene af en mikrotiterplade med 96 brønde. Synkroniseret L4 / unge voksne C. elegans dyr overføres til brøndene (5-8 dyr / brønd) og overlevelse måleshver time indtil de fleste orme er døde. Når du udfører en oxidativ stress modstand under anvendelse en lav koncentration af stressfaktorer i plader, aldring kan påvirke adfærden hos dyr upon oxidativ stress, som kan føre til en fejlagtig fortolkning af data. Men i assayet beskrevet heri, er usandsynlig, da kun L4 / unge voksne dyr bliver brugt dette problem. Desuden er denne protokol er billig og resultater opnås på én dag, hvilket gør denne teknik attraktivt for genetiske skærme. Samlet set vil dette hjælpe til at forstå oxidative stress signaltransduktionsveje, som kunne omsættes til en bedre karakterisering af oxidative stress-associeret menneskelige lidelser.
Introduction
I eukaryoter, oxidativ fosforylering finder sted i elektron transportkæden af mitokondrier er den vigtigste drivkraft for energiproduktion i form af ATP. Reaktive oxygenarter (ROS) er et naturligt biprodukt af denne proces. På trods af deres vigtige rolle som signalmolekyler, kan overdreven ROS føre til DNA-skader, protein carbonylering og lipid oxidation. En ubalance mellem ROS produktion og afgiftning forårsager oxidativt stress, hvilket fører til energiudtømmelse, cellulære skader, og udløser celledød 1,2. Oxidativt stress bidrager til aldring og til udviklingen af mange livstruende sygdomme, herunder kræft, diabetes, hjerte-kar og neurodegenerative sygdomme 3-9.
Celler har udviklet enzymatiske og ikke-enzymatiske forsvarsstrategier at opretholde ordentlig ROS niveauer, og for at beskytte deres vælgere mod oxidativ skade 1,2. Superoxiddismutase (SOD) enzymer virker først til Convert superoxid til H 2 O 2, som senere omdannes til vand ved katalase eller peroxidase enzymer. Ikke enzymatiske forsvarsstrategier omfatter hovedsagelig molekyler der reagerer hurtigere med ROS i sammenligning med cellulære makromolekyler, beskyttelse essentielle cellulære komponenter. På trods af den beskyttende rolle ROS afgiftende enzymer, nogle ROS molekyler undslippe antioxidant forsvarsmekanismer og føre til oxidative skader. Detection, reparation, og nedbrydning af de beskadigede cellulære komponenter er vigtige forsvarsstrategier under oxidativ stress 1,2.
Signalveje, der er involveret i stress resistens og specifikt oxidativ stress er stærkt evolutionært konserverede 10,11. I modsætning til celle kultur eksperimenter, hvor organismal betingelser er kun delvist gengives, studiet af oxidativt stress i modelorganismer 12,13 har stor betydning. C. elegans er en fritlevende nematode, der kan være let og billigt cultured på en bakteriel plæne på agar medie. Det er lille i størrelse (ca. 1 mm i længden) og normalt vokser som en selvstændig befrugtende hermafrodit, hvilket letter genetiske manipulationer. Det har en hurtig livscyklus og en høj reproduktionsevne, der producerer omkring 300 afkom pr generation, hvilket gør det et stærkt værktøj til at udføre store genetiske skærme 14. C. elegans genom er fuldt sekventeret og 40-50% af generne forudsiges at være homologer af human sygdom-associerede gener 15-18. Knockdown af gener af interesse ved anvendelse RNAi er hurtigt og let i C. elegans. Gene nedregulering kunne opnås ved at fodre dyr E. coli-bakterier, der huser et plasmid, der udtrykker dobbeltstrenget RNA, som målretter mRNA'et af interesse 19. Derfor bestemmelse af gen-funktion ved hjælp af store skala RNAi skærme har stor betydning for forståelsen af menneskelige sygdomme, herunder kræft 20,21.
Undersøgelser af oxidative stress modstand i C. elegans har ført til identifikation af konserverede resistensmekanismer til oxidativ stress 13,22. Nogle veje identificeret, er almindelige veje, der modulerer lang levetid og modstandsdygtighed over for andre spændinger samt såsom hypoksi, varme og osmotisk stress. Disse veje omfatter insulin signalering, TOR signalering, og autophagy. Andre vigtige veje involverer afgiftning af ROS såsom superoxiddismutase enzymer og katalase-enzymer, eller skader reparation såsom varmechok og chaperoneproteiner 11,13,22.
Denne protokol beskriver, hvordan at bestemme modstanden mod oxidativ stress C. elegans i væske. Vi brugte flcn-1 (ok975) og vild-type dyr at demonstrere protokollen, da vi tidligere har vist en øget modstand mod oxidativ stress på tab af flcn-1 (ok975) i C. elegans 23. Vi har også vist, at denne øgede modstand afhængerpå AMPK og autophagy, et signalsystem akse, der forbedrer cellulære bioenergetik og fremmer stress modstand 23. PQ er en oxidativ stressor, der forstyrrer elektrontransportkæden at producere reaktive oxygenarter 24. Det samme assay kan tilpasses og andre ROS kilder eller ROS genererer forbindelser kunne anvendes, såsom H 2 O 2 og rotenon. Lignende analyser er blevet udviklet på plader, hvor lave koncentrationer af PQ anvendes 25,26. Fordelen ved dette assay er, at det er meget hurtig, og resultaterne kunne opnås på én dag. Derudover, det samlede volumen af væske, der anvendes til at udføre den oxidative stress resistens assay i 96 brønds plader er lav i forhold til den mængde der anvendes til fremstilling PQ-holdige plader. Derfor er mængden af PQ anvendes, er i flydende assay er lav, hvilket gør assayet billig og begrænser produktionen af giftigt affald. Dog begrænsninger dette assay sammenlignet med plade-assays omfatter lack af fødevarer i flydende assay og den lavere koncentration af oxygen i væske i forhold til luft. Disse er vigtige faktorer, der i nogle tilfælde kan påvirke resultaterne. Derfor bekræfter reproducerbarhed ved hjælp af andre metoder til oxidativ stress resistens anbefales at understøtte resultaterne opnået i dette assay.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans er en attraktiv model organisme for at studere genetisk oxidativt stress resistens in vivo, eftersom det kan være let dyrkes, og hurtigt fører til et stort antal genetisk identiske afkom. Flere metoder til måling oxidativt stress resistens er tidligere blevet beskrevet, og de er baseret på tilskud af dyrkningsplader med forskellige ROS kilder såsom PQ, rotenon, H 2 O 2, og juglone 25,26,29-32. Her beskriver vi en protokol der måler oxidativt stres…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Caenorhabditis Genetik Center for C. elegans-stammer. Finansiering støtte blev leveret af Terry Fox Research Institute. Vi anerkender også støtte til EP fra Rolande og Marcel Gosselin Graduate Studentship og CIHR / FRSQ træning tilskud i kræftforskning FRN53888 af McGill Integrated Cancer Research Training Program.
Materials
| Agar bacteriological grade | Multicell | 800-010-LG | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Sodium chloride biotechnology grade | Bioshop | 7647-14-5 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure tris hydrochloride | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris aminomethane | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicillin | Bioshop | 69-52-3 | |
| Yeast extract | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| Methyl viologen dichloride hydrate | Aldrich chemistry | 856177-1G | |
| Petri dish 60x15mm | Fisher | FB0875713A | |
| Pipet 10ml | Fisher | 1367520 | |
| Potassium phosphate monobasic | G-Biosciences | RC-084 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M-5921 | |
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | |||
| 96 well clear microtiter plate | |||
| flcn-1 RNAi source | Ahringer Library | ||
Referências
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases. Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).
- Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).
- Trushina, E., McMurray, C. T. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neurociência. 145, 1233-1248 (2007).
- Touyz, R. M., Briones, A. M. Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension. Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).
- Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).
- Sosa, V., et al. Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).
- Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).
- Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging. Trends Genet. 29, 367-374 (2013).
- Hope, I. A. . Practical approach series. , 282 (1999).
- C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Ahringer, J. Turn to the worm!. Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).
- Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. Human and nematode orthologs–lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans. Gene. 238, 163-170 (1999).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).
- Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research. Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).
- Moreno-Arriola, E., et al. Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor. Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).
- Possik, E., et al. Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival. PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).
- Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metab. 6, 280-293 (2007).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77, 71-94 (1974).
- Timmons, L. Delivery methods for RNA interference in. C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).
- Wang, B. Y., et al. Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance. Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).
- Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans. PLoS One. 9, 97924 (2014).
- Ward, J. D., et al. Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses. PLoS One. 9, 92552 (2014).
- Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress. PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).
- Greer, E. L., et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in. C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
- Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).
- Apfeld, J., O’Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans. Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).
- Lee, H., et al. The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior. J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).
- Honda, Y., Honda, S. The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).
- Restif, C., Metaxas, D. Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies. Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).
- Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neurosci. 10, 84 (2009).
