Mätning Oxidativ stress Resistans<em> Caenorhabditis elegans</em> I 96-brunnars mikrotiterplattor
Summary
C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.
Abstract
Oxidativ stress, vilket är resultatet av en obalans mellan produktion och avgiftning av reaktiva syreradikaler är en stor bidragande orsak till kroniska mänskliga sjukdomar, bland annat hjärt- och neurodegenerativa sjukdomar, diabetes, åldrande och cancer. Därför är det viktigt att studera oxidativ stress inte bara i cellsystem, men också med hjälp av hela organismer. C. elegans är en attraktiv modellorganism för att studera genetiken av oxidativ stress signaltransduktionsvägar, vilket är mycket evolutionärt bevarade.
Här ger vi ett protokoll för att mäta oxidativ stress motstånd i C. elegans i flytande. Kortfattat, ROS-inducerande reagens såsom parakvat (PQ) och H2O 2 löses i M9-buffert, och lösningarna alikvoterades i brunnarna i en 96 brunnars mikrotiterplatta. Synkroniserad L4 / unga vuxna C. elegans djur överförs till brunnarna (5-8 djur / brunn) och överlevnad mätsvarje timme tills de flesta maskar är döda. När du utför en oxidativ stress motstånd analys med hjälp av en låg koncentration av stressorer i plattor, åldrande kan påverka beteendet hos djur vid oxidativ stress, vilket skulle kunna leda till en felaktig tolkning av data. Men i den analys som beskrivs häri, är osannolik eftersom endast L4 / unga vuxna djur används detta problem. Dessutom är detta protokoll billigt och resultat erhålls under en dag, vilket gör denna teknik attraktivt för genetiska skärmar. Sammantaget kommer detta att bidra till att förstå oxidativ stress signaltransduktionsvägar, vilket kan översättas till bättre karakterisering av oxidativ stress associerade humana störningar.
Introduction
I eukaryoter är oxidativ fosforylering sker i elektrontransportkedja mitokondrierna den främsta drivkraften för energiproduktion i form av ATP. Reaktiva syrespecies (ROS) är en naturlig biprodukt av denna process. Trots deras viktiga roll som signalmolekyler, kan överdriven ROS leda till DNA-skada, protein karbonylering och lipidoxidation. En obalans mellan ROS produktion och avgiftning orsakar oxidativ stress, vilket leder till energibrist, cellskador, och utlöser celldöd 1,2. Oxidativ stress bidrar till åldrande och till utvecklingen av många livshotande sjukdomar, inklusive cancer, diabetes, hjärt- och neurodegenerativa sjukdomar 3-9.
Celler har utvecklats enzymatiska och icke-enzymatiska försvarsstrategier för att upprätthålla rätt ROS nivåer och för att skydda sina väljare mot oxidativ skada 1,2. Superoxiddismutas (SOD) enzymer agera först till convert superoxid till H 2 O 2, som senare omvandlas till vatten genom katalas eller peroxidasenzymer. Icke enzymatiska försvarsstrategier omfattar främst molekyler som reagerar snabbare med ROS jämfört med cellulära makromolekyler, som skyddar viktiga cellkomponenter. Trots den skyddande roll ROS avgifta enzymer, vissa ROS molekyler fly antioxidant försvarsmekanismer och leda till oxidativ skada. Upptäckt, reparation, och nedbrytning av de skadade cellulära komponenter är viktiga strategier försvar under oxidativ stress 1,2.
Signalvägar som är involverade i stresstålighet och specifikt oxidativ stress är mycket evolutionärt konserverade 10,11. Till skillnad från cellodlings experiment där organism villkor endast delvis återges, studiet av oxidativ stress i modellorganismer 12,13 har stor betydelse. C. elegans är en fritt levande nematoden som kan vara enkelt och billigt cultured på en bakteriematta på agarmedium. Den är liten i storlek (ca 1 mm i längd) och normalt växer som en själv fertilizing hermafrodit, vilket underlättar genetiska manipulationer. Den har en snabb livscykel och en hög fortplantningsförmåga, producerar ca 300 avkommor per generation, vilket gör det till ett kraftfullt verktyg för att utföra storskaliga genetiska skärmar 14. C. elegans genomet är helt sekvens och 40-50% av generna spås bli homologer av sjukdomsassocierade gener 15-18 mänskliga. Den knockdown av gener av intresse att använda RNAi är snabb och lätt i C. elegans. Gene nedreglering skulle kunna uppnås genom att mata djur E. coli bakterier som hyser en plasmid som uttrycker det dubbelsträngade RNA som riktar mRNA av intresse 19. Därför bestämning av geners funktion med hjälp av storskaliga RNAi skärmar har stor inverkan på att förstå mänskliga sjukdomar inklusive cancer 20,21.
Studier av oxidative stresstålighet i C. elegans har lett till identifiering av konserverade resistensmekanismer till oxidativ stress 13,22. Vissa vägar som identifierats är vanliga vägar som modulerar livslängd och motståndskraft mot andra påfrestningar samt såsom hypoxi, värme och osmotisk stress. Dessa vägar innefattar insulinsignalering, TOR signalering, och autophagy. Andra viktiga vägar innebär avgiftning av ROS såsom superoxiddismutas enzymer och katalas enzymer, eller reparera skadorna som värmechock och chaperonproteiner 11,13,22.
Detta protokoll beskriver hur man bestämmer motståndet mot oxidativ stress C. elegans i flytande. Vi använde flcn-1 (ok975) och vildtyp djur för att demonstrera det protokoll eftersom vi tidigare har visat en ökad motståndskraft mot oxidativ stress vid förlust av flcn-1 (ok975) i C. elegans 23. Vi har också visat att denna ökade motståndet berorpå AMPK och autophagy, en signalerings axel som förbättrar cellulära bioenergetik och främjar stresstålighet 23. PQ är en oxidativ stressfaktor som interfererar med elektrontransportkedjan att producera reaktiva syrespecies 24. Samma analys skulle kunna anpassas och andra ROS källor eller ROS genererar föreningar skulle kunna användas, såsom H2O 2 och rotenon. Liknande analyser har utvecklats på plattor där låga koncentrationer av PQ används 25,26. Fördelen med denna analys är att den är mycket snabb, och resultaten kunde erhållas i en dag. Dessutom är den totala volymen av vätska som används för att utföra den oxidativa stresstålighet analys i plattor med 96 brunnar med låg jämfört med den volym som används för att framställa PQ-innehållande plattor. Därför är mängden av PQ används i den flytande analysen är låg, vilket gör analysen billigt och begränsar produktionen av giftigt avfall. Emellertid begränsningar av denna analys jämfört med platt analyser innefattar den lack av livsmedel i vätske analysen och den lägre koncentrationen av syre i vätskan jämfört med luft. Dessa är viktiga faktorer som i vissa fall kan påverka resultaten. Därför bekräftar reproducerbarhet med användning av andra metoder för oxidativ stress beständighet rekommenderas att stödja resultat som erhållits i denna analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans är ett attraktivt modellorganism för att studera genetiskt oxidativ stress resistens in vivo eftersom den lätt kan odlas, och snabbt leder till ett stort antal genetiskt identiska avkomma. Flera metoder för att mäta oxidativ stressresistens har tidigare beskrivits, och de är baserade på komplettering av odlingsplattor med olika ROS källor såsom PQ, rotenon, H2O 2, och juglone 25,26,29-32. Här beskriver vi ett protokoll som mäter oxidativ stress motstånd i v?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner Caenorhabditis Genetics Centrum för C. elegans-stammar. Finansiering stöd tillhandahölls av Terry Fox Research Institute. Vi erkänner också stödet till EP från Rolande och Marcel Gosselin Graduate anställning och CIHR / FRSQ utbildningsstipendium inom cancerforskningen FRN53888 av McGill integrerade Cancer Research Training Program.
Materials
| Agar bacteriological grade | Multicell | 800-010-LG | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Sodium chloride biotechnology grade | Bioshop | 7647-14-5 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure tris hydrochloride | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris aminomethane | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicillin | Bioshop | 69-52-3 | |
| Yeast extract | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| Methyl viologen dichloride hydrate | Aldrich chemistry | 856177-1G | |
| Petri dish 60x15mm | Fisher | FB0875713A | |
| Pipet 10ml | Fisher | 1367520 | |
| Potassium phosphate monobasic | G-Biosciences | RC-084 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M-5921 | |
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | |||
| 96 well clear microtiter plate | |||
| flcn-1 RNAi source | Ahringer Library | ||
Referências
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases. Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).
- Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).
- Trushina, E., McMurray, C. T. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neurociência. 145, 1233-1248 (2007).
- Touyz, R. M., Briones, A. M. Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension. Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).
- Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).
- Sosa, V., et al. Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).
- Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).
- Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging. Trends Genet. 29, 367-374 (2013).
- Hope, I. A. . Practical approach series. , 282 (1999).
- C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Ahringer, J. Turn to the worm!. Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).
- Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. Human and nematode orthologs–lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans. Gene. 238, 163-170 (1999).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).
- Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research. Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).
- Moreno-Arriola, E., et al. Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor. Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).
- Possik, E., et al. Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival. PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).
- Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metab. 6, 280-293 (2007).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77, 71-94 (1974).
- Timmons, L. Delivery methods for RNA interference in. C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).
- Wang, B. Y., et al. Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance. Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).
- Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans. PLoS One. 9, 97924 (2014).
- Ward, J. D., et al. Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses. PLoS One. 9, 92552 (2014).
- Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress. PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).
- Greer, E. L., et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in. C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
- Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).
- Apfeld, J., O’Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans. Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).
- Lee, H., et al. The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior. J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).
- Honda, Y., Honda, S. The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).
- Restif, C., Metaxas, D. Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies. Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).
- Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neurosci. 10, 84 (2009).
