В естественных изображений и слежения за технеция-99m меченого костного мозга мезенхимальных стволовых клеток в Коневодство Tendinopathy
Summary
This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.
Abstract
Последние достижения в применении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (BMMSC) для лечения сухожилий и связок травмы в коня предлагаю улучшения исхода меры в обоих экспериментальных и клинических исследований. Несмотря на то, BMMSC имплантируют в сухожилия поражения в больших количествах (обычно 10 – 20 млн клеток), только относительно небольшое число выжить (<10%), хотя они могут сохраняться до 5 месяцев после имплантации. Это, как представляется, общее наблюдение у других видов, где BMMSC были имплантированы в другие ткани, и это важно понимать, когда это происходит потеря, сколько выдержит начальный процесс имплантации и ли клетки будут очищены в другие органы. Отслеживание судьбу клетки может быть достигнуто путем радиоактивной метки в BMMSC до имплантации, которая позволяет неинвазивным в естественных изображений расположения клеток и количественного определения числа клеток.
Этот протокол описывает клеток labeliПроцедура нг, который использует технеция-99m (Тс-99m), и отслеживание этих клеток после имплантации в поврежденный сухожилий сгибателей в лошадей. Tc-99m является кратковременным (т 1/2 от 6,01 ч) изотопом, который испускает гамма-лучи и может быть усвоены клеток в присутствии липофильное соединение hexamethylpropyleneamine оксима (HMPAO). Эти свойства делают его идеальным для использования в клиниках медицины ядерных для диагностики многих различных заболеваний. Судьба меченых клеток можно проследить в краткосрочной перспективе (до 36 ч) по гамма-сцинтиграфии количественного и число клеток, удерживаемых в поражении и распределения клеток в легких, щитовидной железы и других органов. Этот метод адаптирован из маркировки лейкоцитов крови и могут быть использованы для изображения имплантированного BMMSC в других органах.
Introduction
Регенеративные стратегии для ремонта больных или поврежденных тканей основаны на мультипотентных стволовых клеток, полученных из различных тканей и имплантированных в пораженной области. Последние достижения в применении аутологичных BMMSC для лечения сухожилий и связок травмы в лошади показали улучшенные итоговые меры в обеих экспериментальных 1-5 и клинические исследования 6. Лошадь является особенно привлекательной моделью для оценки эффективности стволовых клеток, связанную лечения, потому что он страдает от возраста и надрываться, связанные травмы сухожилий дистального передних конечностей, это спортивная животных, и это большой, облегчая восстановление костного мозга и точная имплантация. Сухожильные травмы заживают естественно, с фиброзом, но исцелил сухожилия функционально уступает 7 и имеет высокий риск повторной травмы 8. Поверхностный цифровой сухожилия сгибателей (SDFT) наиболее часто поражаются, как она развивалась, чтобы действовать в качестве упругой энергиимагазин и опыт высокое содержание подчеркивает достижения энергоэффективных и высокоскоростной передвижения. Восстановление функции после травмы, поэтому решающее значение. Эти травмы аналогичны тем, которые влияет на Ахиллово сухожилие в организме человека, который выполняет ту же функцию 9. Там нет хороших методов лечения для лечения или достижения хороший ремонт для таких травм, поэтому на основе клеток регенеративные стратегии предлагают привлекательную возможность для улучшения результатов и уменьшить повторную травму.
В большинстве исследований 5 – 20 млн аутологичных BMMSC вводят непосредственно в очаг, который, как правило, происходят в ядре тела сухожилия, которые, следовательно, выступает в качестве сосуда для клеток. Судьба клеток вводили один раз не ясно, и различные методы мечения клеток, чтобы отслеживать клетки были описаны в последнее время. Клетки, меченные флуоресцентной меткой в были показаны, чтобы выжить только в относительно небольших количествах (<10%) 10,11. Флуоресцентные метки требуютизвлечение тканей и секционирования для гистологического анализа, который требует много времени и не легко облегчить временной анализ в значительной животной модели или в клинических случаев. В более поздней работе мы использовали радиоизотопный 99m Tc маркировать клетки и следить за их судьбу с помощью гамма сцинтиграфии 1. Этот метод позволяет быстро проводить сравнения между различными маршрутов доставки клеток, в том числе в очаг поражения, внутривенных через яремную вену 1 или региональной перфузии через внутри артериальных 12 или внутривенных инъекций 1,12. Сохранение и распространение клеток, то могут быть отображены с помощью гамма-сцинтиграфии различных органов. Это продемонстрировало, что только 24% клеток вводили intralesionally оставались в поражении на 24 часов 1, и это поддерживается другом исследовании с использованием экспериментально созданные поражений и с использованием того же радиоактивную 5. Кроме того, клетки показывают ограниченную способность к дому в сухожилие, когда поражений delivereD региональной перфузии или внутривенно, но разошлись в легкие последним маршрутов 4.
BMMSC помечены наночастиц железа является альтернативным методом для отслеживания клетки, имплантированные в передних конечностей сухожилий 13. Хотя железа наночастиц меченые клетки позволяет отслеживать клеток в живом организме с помощью МРТ, временные исследования в значительной животного ограничены количество раз анестезии можно вводить в каждый момент времени для выполнения сканирования МРТ в. Кроме того, наночастицы железа в hypointense на МРТ, которая ограничивает информацию о миграции меченых клеток в организм сухожилия. Другие радиоизотопы, которые могут быть использованы, включают индий-111, но это страдает тем недостатком, более длительный период полураспада, чем Tc-99m (2.8 дней против 6,0 ч) и более высокую энергию излучения гамма-. Кроме того, жизнеспособность клеток, как сообщалось, быть уменьшено, если помечены индий-111 14. Tc-99m, с другой стороны, обычно используется в обоих лошадей и человека ядерногомедицина маркировать одноядерные клетки периферической крови и следить за их распространение в естественных условиях по сцинтиграфии. Это может быть относительно легко поглощается клетками с использованием в качестве HMPAO линкерной молекулы для связывания технеций, а Tc-99m-HMPAO, к клеткам. Тс-99m-HMPAO помечены BMMSC показать хорошую жизнеспособность и могут размножаться в пробирке 4. Этот протокол детали маркировки и отслеживания лошадей аутологичных BMMSC имплантированный в природе поражений в передних конечностей SDFT.
Важно отметить, что протокол предназначен только для использования в качестве исследовательского инструмента. Его использование в качестве клинического лечебного воздействия не рекомендуется, поскольку эффект радиоактивной метки на клеточного фенотипа имеет полностью не выяснены.
Protocol
Representative Results
Discussion
В дополнение к костного мозга, стволовые клетки, выделенные из источников, таких как жировая ткань подходят для маркировки с этим протоколом. Кроме того, клетки из замороженного состояния может быть восстановлена и расширена в культуре к желаемым номерам для маркировки исследовани…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding from the Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) and VetCell BioScience Ltd, U.K. and by Consejerìa de Innovaciòn, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucìa, Spain.
Materials
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec – Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18G and 19G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18G); NN1938R (19G) | |
| Syringes 1 mL and 2 mL | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
Referências
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, 23-26 (1997).
- O’Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
