نظم هيلا خلية استنادا حرية التعبير للتعبير عن<em> المتصورة</em> المقيرع البروتينات
Summary
التعبير عن البروتينات ملاريا في نظم الخلايا استنادا يظل تحديا. علينا أن نبرهن خطوتين واحد IVT خطوة (في الترجمة المختبر) نظم خلايا حرية التعبير للتعبير عن الملاريا البروتينات المقيرع المؤتلف من خلايا هيلا. ونحن نستخدم نظام تنقية أساس ني راتنج تقارب لتنقية البروتينات المقيرع.
Abstract
الملاريا يسبب الاعتلال عالمي كبير والوفيات. لا يوجد لقاح الروتيني هو متاح حاليا. واحدة من الأسباب الرئيسية لعدم وجود لقاح هو تحدي تحديد المرشحين لقاح مناسب. وأعرب البروتينات ملاريا باستخدام والغليكوزيلاتي نظم التعبير خلية بدائية النواة مقرها وحقيقية النواة سيئة، غير قابلة للذوبان بشكل عام، والخضوع للطي غير لائق مما أدى إلى انخفاض المناعة. تستخدم أنظمة حرية التعبير جنين القمح، المحللة أرنب الخلايا الشبكية والإشريكية القولونية الخلايا المحللة حاليا للتعبير عن البروتينات ملاريا. ومع ذلك، فإن طول الفترة الزمنية التعبير وبالغليكوزيل غير لائق من البروتينات لا يزال يشكل تحديا. علينا أن نظهر التعبير عن البروتينات المتصورة في المختبر باستخدام نظم حرية التعبير خلية مقرها هيلا، ووصف "في المختبر الخلية الحرة أنظمة التعبير الإنسان". نظم حرية التعبير خلية استنادا 2 هيلا نسخ مرنا في 75 دقيقة و 3 ميكرولتر من transcribإد مرنا غير كاف لترجمة البروتينات في 90 دقيقة. نظام التعبير 1-الخطوة هو النسخ والترجمة نظام التعبير مقترنة؛ يحدث النسخ وشارك في الترجمة في 3 ساعات. ويمكن أيضا أن تمتد عملية لمدة 6 ساعة خلال توفير طاقة إضافية. في نظام التعبير 2-الخطوة، هو كتب مرنا أولا ثم تضاف إلى مزيج ترجمة للتعبير البروتين. وصفنا كيفية التعبير عن بروتينات الملاريا؛ ومسعور شق PF3D7_0114100 ماورر – 2 الغشاء (PfMC-2TM) بروتين، بروتين PF3D7_0925900 ماء ويكرر أرماديلو تحتوي على البروتين PF3D7_1361800، وذلك باستخدام نظام حرية التعبير الخلية هيلا القائمة. يتم التعبير عن البروتينات بكميات صغيرة توظيف استراتيجيات التعبير 2-خطوة و1-الخطوة. طريقة تنقية تقارب لتنقية 25 ميكرولتر من البروتينات وأعرب باستخدام أيضا يوصف الخلية البشرية نظام حرية التعبير في المختبر. يتم تحديد العائد البروتين عن طريق فحص برادفورد وأعربتوتنقية البروتينات يمكن التأكد من خلال تحليل النشاف الغربي. البروتينات المؤتلف وأعرب يمكن استخدامها لالتحصينات، المناعية والتسلسل البروتين.
Introduction
في أبحاث الملاريا، التعبير عن البروتينات المناعية باستخدام نظم الخلايا أولية النواة أو حقيقية النواة تستند لا يزال يشكل تحديا. ثراء AT من الجينوم المتصورة والآليات آخر متعدية غير معروفة 14،7، والمساهمة في الصعوبات المرتبطة بالحصول على البروتينات مطوية ومناعة سليم للدراسات إنتاج الأجسام المضادة واللقاحات. نظم الكائنات الحية بدائية مثل الإشريكية القولونية استخدمت لالمؤتلف تعبير البروتين. أنظمة بدائية النواة هي منخفضة التكلفة، وفعالة، تنتج غلة عالية من البروتين المؤتلف ويكون ناقلات الاستنساخ متعددة. استضافة E. خلايا القولونية هي سهلة لتحويل والخلايا تنمو بسرعة. ومع ذلك، وأنظمة بدائية النواة لديها قيود مثل نقص حمض أميني تبديل أو تعديل آخر متعدية، خطر التلوث والمنتجات غير متجانسة وتراكم البروتينات المؤتلف ضمن الهيئات إدراج 24.
فيالدراسة التي Mehlin وآخرون (2006)، وأعرب عن 1000 إطارات القراءة المفتوحة (ORF). وكانت حوالي 7٪ من البروتينات القابلة للذوبان وأعرب 14. ويرجع ذلك إلى طبيعة منحازة للجينات وتيرة عالية من الكودونات التي يتم استخدامها بشكل مثالي من قبل المتصورة AT الجينوم الغني 14 الذوبان الملاحظة. وقد وضعت استراتيجية بديلة للتغلب على هذه المشكلة عن طريق استخدام البلازميدات أو الخلايا المضيفة التي تحتوي على tRNAs التي تعترف كودونات نادرة أو الكودونات التي تطابق الترددات 3. حتى بعد تنفيذ هذه التحسينات، يتم التعبير عن أجزاء صغيرة جدا من البروتينات كما قابل للذوبان، ونشط ومناعة 14. نظم التعبير خالية من الخلايا تحتوي على جميع العناصر الضرورية للالنسخ والترجمة مثل ريبوسوم، والعوامل بدء، عوامل استطالة (العوامل ترجمة)، الحمض الريبي النووي النقال وsynthetases أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال. تقترن كل من ردود الفعل النسخ والترجمة في خطوة واحدة الإجراء 11،29. وtranscriيتم تنفيذ رد فعل ption في أنبوب قبل المحتضنة كمية مناسبة من مرنا مع الآلات الترجمة في أنبوب 11،29 مختلفة. على الرغم من أن هذه الأساليب الناجحة في المتصورة ليرة سورية. البروتين التعبير، وهو العيب الرئيسي هو طول الوقت للتعبير البروتين، وهو ما يقرب من 22 ساعة 29. وبالإضافة إلى ذلك، وارتفاع تكلفة إمدادات لإدراجها في البروتوكولات 29، الاستعدادات كثيفة العمالة من الخلايا المحللة والتناقضات في الأعمال التحضيرية المكونة، وجعل هذه الأنظمة غير قابلة للتحقيق. التركيز الرئيسي من الباحثين عن تطوير نظام حرية التعبير الخلية يعتمد على عوامل مثل التعديل الوراثي السريع، عوائد سريعة مع تركيزات عالية ومباشرة الاستعدادات المحللة إلى الأمام 1.
نظم حقيقية النواة مثل الخميرة، وخطوط خلايا الثدييات، العصوي بوساطة نظام التعبير، رباعية الغشاء thermophilia، Dictyostelium discoideum ونظم التعبير الطفيلية سووقد استخدمت الفصل كما الليشمانيا للبروتين المؤتلف التعبير 7. نظم حقيقية النواة تتقاسم علاقة النشوء والتطور، وبالتالي تشترك أيضا خصائص مثل بالغليكوزيل، أسيلة، تشكيل السندات ثاني كبريتيد، والتفاعل كوصي، التحلل البروتيني والتقسيم الفرعي الخلوية. أحداث إفراز البروتين في حقيقيات النوى تمنع تراكم والنقصان سمية لأنظمة التعبير 13. ويفضل استخدام نظم الخميرة كما أنها مناسبة للتعبير البروتين في نطاق واسع والحصول على عوائد عالية 4. اثنين P. تم إنتاج البروتينات المنجلية PfCP-29 و Pvs25 باستخدام نظام الخميرة 4. ومع ذلك، كان العائق الرئيسي في تركيب معظم البروتينات غير النظامية N و O-بالغليكوزيل أنماط، قابلة للطي غير لائق والاقتطاع من البروتينات من النموذج الأصلي من 4.
استخدام خلايا الثدييات لتخليق البروتينات المؤتلف هو كثيفة العمالة وexpen ذلكSIVE للحفاظ على خطوط الخلايا المؤتلف مستقرة 4. وبالتالي، خلايا الثدييات كانت محدودة لتحليل الإشارات البروتين، وتفاعلات البروتين وتفاعلات الطفيلي المضيف وأيضا لاختبار لقاحات الحمض النووي (4). الحمض النووي البشري ومرنا في المختبر تعبير البروتين نظام خالية من الخلايا الموصوفة هنا هو نظام المستمدة من الخلايا هيلا أساس الثدييات التي تعبر عن البروتينات في 3 ساعات. وأعرب البروتينات باستخدام pT7CFE1-CHIS التعبير ناقلات وعلامة-C محطة تسهيل تحديد وتنقية. ويكمل النظام القائم هيلا مع العوامل ترجمة بدء ومنظم الترجمة، وبالتالي تعزيز كفاءة نظام الترجمة. البروتينات يمكن أن تترجم بسرعة، فحص، التحقق ومعالجتها لاستخدامها في مختلف التطبيقات المناعية والهيكلية 15.
وتستخدم حقيقية النواة نظم التعبير خالية من الخلايا مثل جرثومة القمح والأرانب الخلايا الشبكية حاليا للتعبير عن فاربروتينات حقيقية النواة] [إيووس] بما في ذلك البروتينات المتصورة 11،29. وبالإضافة إلى ذلك، E. ويعمل نظام خالية من الخلايا استنادا القولونية أيضا لحقيقيات النوى التعبير البروتين 11. ويلخص الجدول 1 مختلف النظم التعبير الخلية الحرة بمقارنة خصائص النظم فضلا عن سهولة استخدام أنظمة للتعبير البروتين. نظام خالية من الخلايا البشرية بالمقارنة مع الآخرين لديه القدرة على أداء وظيفة وشارك متعدية التعديلات وأقل تكلفة. كودون الأمثل هو ممكن، وجميع ردود الفعل لا يمكن أن يؤديها في 3 ساعات. نظام هيلا هو نظام ترجمة مثالية لتخليق البروتين في المعمل.
والميزة الرئيسية لنظم التعبير الخلية الحرة الإنسان على غيره من الأنظمة الحرة الخلية توافر عدة خطوط مختلفة من الخلايا المشتقة من أعضاء وأنسجة مختلفة. ويمكن تصميم عدة أنواع من الأنظمة الحرة خلية اعتمادا على خط الخلية. استخراجالصورة المشتقة من خلايا الثدييات لها كفاءة أعلى لتجميع البروتينات كبيرة من أي أنظمة أخرى التعبير الخلية الحرة. ويمكن أيضا أن هذه الأنظمة خلية حرية التعبير يمكن استخدامها في تطبيقات توصيف التشخيص والبروتين مثل المصفوفات الدقيقة 30. وتستخدم على نطاق واسع في خطوط الخلايا شعبية هيلا لتنفيذ التعبير عن البروتينات 33. الشبكة الإندوبلازمية في خطوط الخلايا هيلا متخلفة، مما يؤدي إلى عدم وجود ارتباط بالغليكوزيل آخر متعدية النشاط تعديل 33. ومع ذلك، يعتقد هذا النظام ليكون من المفيد لالمتصورة تخليق البروتين كما تفتقر أيضا المتصورة آخر بالغليكوزيل الترجمة تعديل 29. الحر بروتوكول النسخ والترجمة الخلية هيلا هو السهل القيام بها، وغير مكلفة ويمكن التعبير عن البروتينات في 90 دقيقة، وعلى استعداد لتنقية ومزيد من التطبيقات المصب.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الهامة للتعبير ناجحا للبروتينات باستخدام اثنين من خطوة في المختبر الخلية البشرية نظام حرية التعبير وتنقية هي: 1) التضخيم ناجحة واستنساخ الجينات إلى pT7CFE-CHIS البلازميد النواقل؛ 2) تدوين الحمض النووي الريبي في 30 درجة مئوية. 3) ترجمة البروتين عند 30 درجة مئوية …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.
Materials
| Two-step in vitro human cell free expression system | Thermo fischer | 88856 | Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| One-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at room temperature |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4oC. |
Referências
- Alexandrov, K., et al. Leishmania. cell-free expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
- Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
- Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
- Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
- Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
- Gowda, D. C., Davidson, E. A. Protein glycosylation in the malaria parasite. Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
- Hinnebusch, A. . Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).
- Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
- Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
- Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
- Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
- Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
- Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
- Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
- Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
- Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
- Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
- Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
- Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
- Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. Rhop-3 protein conservation among Plasmodium. species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).
- Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
- Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
