HeLa basis Cell vrije expressie systemen voor expressie van<em> Plasmodium</em> Rhoptry Eiwitten
Summary
Expressie van malaria eiwitten in cellen gebaseerde systemen blijft uitdagend. We tonen twee stappen en een stap IVT (in vitro translatie) celvrije expressiesystemen voor het uitdrukken van malaria rhoptry recombinante eiwitten uit HeLa-cellen. We maken gebruik van een Ni-gebaseerde hars affiniteit zuiveringssysteem de rhoptry eiwitten te zuiveren.
Abstract
Malaria veroorzaakt aanzienlijke wereldwijde morbiditeit en mortaliteit. Geen routine vaccin is momenteel beschikbaar. Een van de belangrijkste redenen voor het ontbreken van een vaccin is het probleem van het identificeren van geschikte vaccin gegadigden. Malaria proteïnen uitgedrukt in prokaryote en eukaryote cellen gebaseerde expressiesystemen worden slecht geglycosyleerd algemeen onoplosbaar ondergaan onjuiste vouwing leidt tot verminderde immunogeniciteit. De tarwekiemen, konijn reticulocytlysaat en Escherichia coli lysaat cel vrije expressie systemen worden momenteel gebruikt voor de expressie van malaria eiwitten. De lengte van de expressieperiode en oneigenlijk glycosylering van eiwitten nog steeds een uitdaging. We tonen expressie van Plasmodium eiwitten in vitro gebruik van HeLa gebaseerde mobiele vrije expressie systemen, aangeduid als "in vitro menselijke cel vrije expressie systemen". De 2 HeLa gebaseerd celvrije expressiesystemen transcriberen mRNA in 75 min en 3 pi transcribed mRNA is voldoende om eiwitten te vertalen in 90 min. De 1-staps expressiesysteem is een transcriptie- en translatie-gekoppelde expressiesysteem; de transcriptie en co-translatie voorkomt in 3 uur. De werkwijze kan ook worden uitgebreid voor 6 uur door extra energie. In de 2-staps expressiesysteem, wordt mRNA eerst getranscribeerd en vervolgens aan het translatiemengsel voor eiwitexpressie. We beschrijven hoe malaria eiwitten tot expressie; een hydrofobe PF3D7_0114100 Maurer's Gespleten – 2 transmembraan (PfMC-2TM) eiwit, een hydrofiele PF3D7_0925900 eiwit en een gordeldier herhalingen bevatten eiwit PF3D7_1361800, met behulp van de HeLa gebaseerde cel vrije expressie systeem. De eiwitten worden tot expressie gebracht in microvolumes gebruik 2 stappen en stap 1 expressie strategieën. Een werkwijze voor affiniteitszuivering 25 gl eiwitten aanwezig gebruikmaking van de in vitro humane celvrij expressiesysteem wordt ook beschreven zuiveren. Eiwitrendement wordt bepaald door de Bradford test en de tot expressie gebrachteen gezuiverde eiwitten kan worden bevestigd door Western blot analyse. Expressie gebrachte recombinante eiwitten kunnen worden gebruikt voor immunisaties, immunoassays en eiwitsequentie.
Introduction
In malaria onderzoek, blijft de expressie van immunogène eiwitten met behulp van prokaryote of eukaryote cellen gebaseerde systemen een uitdaging. De AT rijkdom van Plasmodium genoom en onbekende posttranslationele mechanismen 14,7, bij aan de problemen geassocieerd met het verkrijgen van correct gevouwen en immunogene eiwitten voor antilichaamproductie en vaccine studies. Prokaryote systemen zoals Escherichia coli werden gebruikt voor recombinante eiwitexpressie. Prokaryotische systemen zijn lage kosten, efficiënte, produceren hoge opbrengsten van recombinante eiwitten en meerdere kloonvectoren. Host E. coli-cellen zijn eenvoudig te transformeren en cellen snel groeien. Echter, prokaryotische systemen hebben beperkingen zoals gebrek aan aminozuursubstitutie, post-translationele modificatie, besmettingsgevaar, heterogene producten en accumulatie van recombinante eiwitten in insluitingslichamen 24.
In eenonderzoek van Mehlin et al. (2006), 1000 open reading frames (ORF) hadden. Ongeveer 7% van de tot expressie gebrachte eiwitten waren oplosbaar 14. De onoplosbaarheid waargenomen wordt veroorzaakt door de voorgespannen aard van de genen en de hoge frequentie van codons die idealiter worden gebruikt door de Plasmodium AT rijke genoom 14. Een alternatieve strategie om dit probleem te ondervangen is ontwikkeld door plasmiden en gastheercellen die tRNAs dat zeldzame codons of codons die overeenkomen met de frequenties 3 herkennen. Zelfs na het uitvoeren van deze optimalisaties, zeer kleine porties eiwitten aanwezig als oplosbare, actieve immunogene 14. De cel-vrije expressie systemen bevatten alle componenten die nodig zijn voor de transcriptie en translatie zoals ribosomen, initiatie factoren, elongatie factoren (vertalingen factoren), tRNA en aminoacyl-tRNA synthetasen. Zowel transcriptie en translatie reacties worden gekoppeld eenstapsprocedure 11,29. De transcription reactie wordt uitgevoerd in een rol voor geschikte hoeveelheid mRNA geïncubeerd met translatie machinerie in een ander buisje 11,29. Hoewel deze werkwijzen succesvol Plasmodium sp. Eiwitexpressie zijn een groot nadeel is de duur van eiwitexpressie, wat ongeveer 22 uur 29. Daarnaast zijn de hoge kosten van benodigdheden voor opneming in de protocollen 29, de arbeidsintensieve preparaten van het cellysaat en inconsistenties in bestanddeel preparaten, maken deze systemen onbereikbaar. De belangrijkste focus van de onderzoekers voor de ontwikkeling van een cel vrije expressie systeem is afhankelijk van factoren zoals de snelle genetische modificatie, snel rendement met een hoge concentraties en straight forward lysaat voorbereidingen 1.
Eukaryote systemen zoals gist, zoogdiercellijnen, baculovirus expressiesysteem gemedieerd, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum en parasitaire expressiesystemen such zoals Leishmania werden gebruikt voor recombinante eiwitexpressie 7. Eukaryote systemen delen fylogenetische relatie en dus ook de kenmerken zoals glycosylering, acylering, de vorming van disulfidebinding, chaperone interactie, proteolyse en sub-cellulaire verkokering te delen. Eiwitsecretie gebeurtenissen in eukaryoten voorkomen accumulatie en verlaagt de toxiciteit voor expressie systemen 13. Het gebruik van gistsystemen heeft de voorkeur aangezien zij geschikt zijn voor eiwitexpressie op grote schaal en voor het verkrijgen van hoge opbrengsten 4. Twee P. falciparum eiwitten PfCP-29 en Pvs25 werden geproduceerd met behulp van de gist systeem 4. Echter, een belangrijk nadeel in de synthese van de meeste eiwitten was onregelmatig N en O-glycosylering patronen verkeerde vouwing en truncatie van eiwitten uit hun natieve vorm 4.
Het gebruik van zoogdiercellen voor de synthese van recombinante eiwitten is arbeidsintensief en wordt expensive stabiele recombinante cellijnen 4 te handhaven. Daarom zijn zoogdiercellen beperkt voor de analyse van eiwit signalering, eiwitinteracties en parasiet-gastheer interacties maar ook voor het testen van DNA-vaccins 4. The Human DNA en mRNA in vitro eiwitexpressie celvrij systeem hierin beschreven is een HeLa-cellen afgeleide-zoogdierlijke systeem dat eiwitten tot expressie in 3 uur. Eiwitten uitgedrukt met behulp pT7CFE1-Chis expressievector hebben een C-terminaal tag vergemakkelijkt de identificatie en zuivering. De HeLa systeem wordt aangevuld met translatie initiatie factoren en een vertaling regulator, waardoor de efficiëntie van het vertaalsysteem verbeteren. Eiwitten kunnen snel worden vertaald gescreend geverifieerd en in diverse immunologische en structurele toepassingen 15 verwerkt voor gebruik.
Eukaryote celvrije expressiesystemen zoals tarwekiemen en konijnen reticulocyten worden momenteel gebruikt voor de expressie van various eukaryotische eiwitten waaronder Plasmodium eiwitten 11,29. Bovendien, E. coli gebaseerde celvrije systemen worden ook toegepast voor eukaryote eiwitexpressie 11. Tabel 1 vat de verschillende celvrije expressiesystemen door vergelijking van kenmerken van de systemen en het gemak van het gebruik van systemen voor eiwitexpressie. De humane celvrij systeem in vergelijking met de anderen heeft de mogelijkheid om post en co-translationele modificaties uitvoeren en goedkoper. Codon-optimalisatie mogelijk en alle reacties in 3 uur worden uitgevoerd. De HeLa-systeem een ideale translatiesysteem voor eiwitsynthese in de laboratoriumopstelling.
Een groot voordeel van humane celvrije expressiesystemen boven andere celvrije systemen is de beschikbaarheid van verschillende cellijnen afkomstig van verschillende organen en weefsels. Verschillende soorten celvrije systemen worden ontworpen, afhankelijk van de cellijn. Het extracts afgeleid van zoogdiercellen hogere efficiëntie grote eiwitten te synthetiseren dan andere celvrije expressiesystemen. De celvrije expressiesystemen kunnen ook worden gebruikt in diagnostische en eiwitkarakterisering toepassingen zoals micro arrays 30. De populaire HeLa cellijnen worden het meest gebruikt voor de expressie van eiwitten 33 te voeren. Het endoplasmatisch reticulum in HeLa cellijnen onvoldoende ontwikkeld, waardoor de afwezigheid van post-translationele modificatie glycosylering activiteit 33. Echter, dit systeem aangenomen voordelig Plasmodium eiwitsynthese te zijn zoals Plasmodium ontbreekt ook glycosylering na translatie modificatie 29. De HeLa celvrije transcriptie-translatie protocol is eenvoudig uit te voeren, goedkoop en eiwitten kunnen tot expressie worden gebracht in 90 min, gereed voor zuivering en toepassingen later.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijke stappen voor een succesvolle expressie van eiwitten onder toepassing tweestaps in vitro humane celvrij expressiesysteem en zuivering zijn: 1) succesvolle amplificatie en klonering van genen in pT7CFE-CHIS plasmidevector; 2) het transcriberen van RNA bij 30 o C; 3) translatie van proteïne bij 30 ° C in aanwezigheid van RNAse inhibitor; 4) de affiniteit gebaseerde zuiveringsprotocol middels harskorrels bekleed met Ni en 5) het analyseren van de resultaten op Western blot met behulp van polyklon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.
Materials
| Two-step in vitro human cell free expression system | Thermo fischer | 88856 | Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| One-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at room temperature |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4oC. |
Referências
- Alexandrov, K., et al. Leishmania. cell-free expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
- Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
- Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
- Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
- Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
- Gowda, D. C., Davidson, E. A. Protein glycosylation in the malaria parasite. Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
- Hinnebusch, A. . Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).
- Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
- Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
- Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
- Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
- Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
- Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
- Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
- Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
- Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
- Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
- Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
- Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
- Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. Rhop-3 protein conservation among Plasmodium. species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).
- Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
- Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
