HeLa Baseret Cell ytringsfrihed Systemer til ekspression af<em> Plasmodium</em> Rhoptry Proteiner

Summary

Ekspression af malaria proteiner i cellebaserede systemer stadig en udfordring. Vi demonstrerer to trin og et skridt IVT (in vitro translation) celle gratis ekspressionssystemer til at udtrykke malaria rekombinante rhoptry proteiner fra HeLa-celler. Vi bruger en Ni-harpiks affinitet baseret rensningssystemet for at oprense rhoptry proteiner.

Abstract

Malaria forårsager betydelig global sygelighed og dødelighed. Ingen rutinemæssig vaccine er i øjeblikket tilgængelig. En af de vigtigste årsager til manglen på en vaccine er udfordringen at identificere egnede vaccinekandidater. Malaria proteiner udtrykkes under anvendelse af prokaryote og eukaryote cellebaserede ekspressionssystemer er dårligt glycosylerede, generelt uopløselige og undergår ukorrekt foldning fører til reduceret immunogenicitet. De hvedekim, kaninreticulocytlysat og Escherichia coli lysat cellefrie ekspressionssystemer øjeblikket anvendes til ekspression af malaria proteiner. Men længden af ​​ekspression tid og forkert glycosylering af proteiner stadig en udfordring. Vi demonstrerer ekspressionen af Plasmodium proteiner in vitro ved hjælp af HeLa baseret celle fri ekspressionssystemer, betegnet "in vitro celle fri ekspressionssystemer menneskelige". De 2 HeLa baseret cellefrie ekspressionssystemer transskribere mRNA i 75 min og 3 pi transcribed mRNA er tilstrækkeligt til at omsætte proteiner i 90 min. Den 1-trins ekspressionssystem er en transkription og translation koblet ekspressionssystem; transkription og co-translation forekommer i 3 timer. Processen kan også udvides til 6 timer ved at give ekstra energi. I 2-trins ekspressionssystem mRNA først transkriberes og derefter tilsat til oversættelse mix for proteinekspression. Vi beskriver, hvordan man kan udtrykke malaria proteiner; en hydrofob PF3D7_0114100 Maurers kløft – 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, et hydrofilt PF3D7_0925900 protein og et bæltedyr gentagelser indeholder protein PF3D7_1361800, ved hjælp af HeLa baserede celle ytringsfriheden system. Proteinerne udtrykkes i mikro mængder anvender 2-trins og 1-trins expression strategier. En affinitet oprensningsmetode at oprense 25 pi proteiner, der udtrykkes ved hjælp af in vitro humane celle fri ekspressionssystem er også beskrevet. Proteinudbytte bestemmes ved Bradfords assay og det udtrykteog oprensede proteiner kan bekræftes ved western blotting-analyse. Udtrykte rekombinante proteiner kan anvendes til immuniseringer, immunassays og protein-sekventering.

Introduction

I malaria forskning, ekspression af immunogene proteiner under anvendelse prokaryote eller eukaryote cellebaserede systemer fortsat en udfordring. AT rigdom af Plasmodium genom og ukendte indlæg translationelle mekanismer ^14,7, bidrage til de vanskeligheder, der er forbundet med at få ordentligt foldede og immunogene proteiner for antistof produktion og vaccine undersøgelser. Prokaryote systemer såsom Escherichia coli er blevet anvendt til rekombinant proteinekspression. Prokaryote systemer er billige, effektive, producerer høje udbytter af rekombinant protein og har flere kloningsvektorer. Vært E. coli-celler er lette at omdanne og celler vokser hurtigt. Men prokaryote systemer har begrænsninger såsom manglende aminosyresubstitution, posttranslationel modifikation, risiko for forurening, heterogene produkter og akkumulering af rekombinante proteiner i inklusionslegemer ^24.

I enundersøgelse af Mehlin et al. (2006), blev 1000 åbne læserammer (ORF) udtrykkes. Ca. 7% af de udtrykte proteiner var opløselige ^14. Uopløseligheden observerede skyldes den forspændte karakter af generne og den høje frekvens af kodoner, der anvendes ideelt set inden Plasmodium AT rige genom ^14. En alternativ strategi til at overvinde dette problem er blevet udviklet ved anvendelse af plasmider eller værtsceller indeholdende tRNA'er der genkender sjældne kodoner eller kodoner, der svarer til frekvenserne ^3. Selv efter udførelse af disse optimeringer, er meget små portioner af proteiner udtrykt som opløselig, aktiv og immunogen ^14. De cellefrie ekspressionssystemer indeholder alle de komponenter, der er nødvendige for transskription og translation, såsom ribosomer, initieringsfaktorer, forlængelse faktorer (oversættelser faktorer), tRNA og aminoacyl-tRNA syntetaser. Både transkriptions- og translationsreaktioner er koblet i ettrinsprocedure ^11,29. Den transcriptio n reaktion udføres i et rør før passende mængde mRNA inkuberes med oversættelse maskiner i et andet rør ^11,29. Selv om disse fremgangsmåder har succes i Plasmodium sp. Proteinekspression, en væsentlig ulempe er længden af tid for proteinekspression, der er ca. 22 timer ^29. Hertil kommer, at høje omkostninger af forsyninger til optagelse i protokollerne ^29, de arbejdskraftintensive præparater af cellelysat og uoverensstemmelser i komponent præparater, gør disse systemer uopnåelige. Hovedfokus for forskere for udvikling af en celle ytringsfrihed systemet afhænger af faktorer såsom hurtig genetisk modifikation, hurtige udbytter med høje koncentrationer og ligetil præparater lysat ^1.

Eukaryote systemer, såsom gær, mammale cellelinier, baculovirus medieret ekspressionssystem, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum og parasitære ekspressionssystemer such som Leishmania er blevet anvendt til rekombinant proteinekspression ^7. Eukaryote systemer deler fylogenetiske forhold, og derfor også dele karakteristika såsom glycosylering, acylering, disulfidbindingsdannelse, chaperone interaktion, proteolyse og sub-cellulær opdeling. Proteinsekretion begivenheder i eukaryoter forhindre ansamling og reducerer toksiciteten for ekspressionssystemer ^13. Anvendelsen af gær-systemer foretrækkes, da de er egnede til proteinekspression i stor skala og til opnåelse af høje udbytter ^4. To P. falciparum-proteiner PfCP-29 og Pvs25 blev fremstillet under anvendelse gærsystemet ^4. Imidlertid en stor ulempe ved syntesen af de fleste af proteinerne var uregelmæssige N og O-glycosyleringsmønstre, forkert foldning og trunkering af proteiner fra deres native form ^4.

Anvendelsen af ​​mammale celler til syntese af rekombinante proteiner er arbejdskrævende, og det er omkostSive at opretholde stabile rekombinante cellelinier ^4. Derfor er pattedyrceller været begrænset til analyse af protein-signalering, protein-interaktioner og parasit-værts-interaktioner og også til afprøvning DNA-vacciner ^4. The Human DNA og mRNA in vitro proteinekspression cellefrit system beskrevet heri er en HeLa-celle-afledt pattedyr-baseret system, der udtrykker proteiner i 3 timer. Proteiner udtrykt ved hjælp pT7CFE1-Chis ekspressionsvektoren har en C-terminal tag letter identifikation og rensning. Den HeLa baserede system suppleres med translationsinitierings- faktorer og en oversættelse regulator, og derved øge effektiviteten af ​​oversættelsen systemet. Proteiner kan hurtigt oversat, afskærmet, verificeret og forarbejdet til brug i forskellige immunologiske og strukturelle applikationer ^15.

Eukaryote cellefrie ekspressionssystemer, såsom hvedekim og kaninreticulocyt øjeblikket anvendes til ekspression af varskellige eukaryote proteiner, herunder Plasmodium proteiner ^11,29. Desuden E. coli baserede cellefrie systemer er også anvendes til eukaryotisk proteinekspression ^11. Tabel 1 opsummerer forskellige cellefrie ekspressionssystemer ved at sammenligne træk ved de systemer samt letheden ved hjælp af systemer til proteinekspression. Den humane cellefrit system i forhold til de andre har evnen til at udføre post- og co-translationelle modifikationer og er billigere. Kodonoptimering er muligt og alle reaktionerne kan udføres i 3 timer. Den HeLa-systemet er et ideelt oversættelsessystem for proteinsyntese i indstillingen laboratorium.

En væsentlig fordel ved humane cellefrie ekspressionssystemer end andre cellefrie systemer er tilgængeligheden af ​​adskillige forskellige cellelinjer afledt af forskellige organer og væv. Flere sorter af cellefrie systemer kan udformes afhængigt af cellelinjen. Ekstraktens afledt fra pattedyrceller har højere effektivitet til at syntetisere store proteiner end nogen andre celle fri ekspressionssystemer. Disse celle fri ekspressionssystemer kan også bruges i diagnostiske og protein karakterisering applikationer såsom mikro arrays ^30. De populære HeLa-cellelinjer anvendes mest til at udføre ekspression af proteiner ^33. Det endoplasmatiske reticulum i HeLa-cellelinjer er underudviklet, hvilket fører til fravær af post-translationel glycosylering modifikationsaktivitet ^33. Imidlertid er dette system menes at være fordelagtig for Plasmodium proteinsyntese som Plasmodium mangler også glycosylering efter translation modificering ^29. Den HeLa cellefri transkription-translation-protokol er let at udføre, billig og proteiner kan udtrykkes i 90 min, klar til rensning og yderligere efterfølgende anvendelser.

Protocol

1. Fremstilling af Parasite Cell Cultures, Indsamling af Parasite Pellets Forbered RPMI-1640-HEPES medier ved tilsætning af 10 g RPMI-1640 pulver, 66 mg gentamycin sulfat, 2 g natriumbicarbonat, 5,9 g HEPES-buffer, 50 mg hypoxanthin og 3,8 g dextrose i 1 liter sterilt dH 2 O. Bland bruge tabel magnetomrører, indtil alt pulveret er opløst i 1 liter destilleret vand. Udfør mikro filtrering af medier ved hjælp 0,22 um filter. Opbevar medier i sterile flasker. Vask uinficeret (friske) ty…

Representative Results

Validering af de udtrykte rekombinante proteiner gennem reaktivitet med specifikke antistoffer er et vigtigt første skridt i at bekræfte korrekt foldning af de udtrykte proteiner. Rekombinante malaria proteiner blev udtrykt ved hjælp af et trin og to skridt i vitro menneskelig celle gratis ekspressionssystemer. De rekombinante proteiner oprenses Ni-chelaterende affinitet metode. Vi derefter brugt antisera mod hele merozoit rhoptries i western blotting af SDS-PAGE separerede rekombinante proteiner. <p class="jove_…

Discussion

De vigtige skridt for en vellykket ekspression af proteiner ved hjælp af to-trins in vitro human celle ytringsfriheden systemet og rensning er: 1) vellykket forstærkning og kloning af gener i pT7CFE-Chis plasmidvektor; 2) overførsel af RNA ved 30 ^° C; 3) oversættelse af protein ved 30 ° C i nærvær af RNAse-inhibitor; 4) udvikling af affiniteten baseret oprensningsprotokol hjælp harpiks perler overtrukket med Ni og 5) analyse resultaterne på western blot under anvendelse af polyklonale og monoklonale…

Materials

Two-step in vitro human cell free expression system	Thermo fischer	88856	Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water
One-step in vitro coupled translation system	Thermo fischer	88860	Always store at -80oC. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system	Invitrogen	K850-01	Store at room temperature
Probond Nickel-Chelating Resin	Invitrogen	R801-01	Store at 4oC.
A+ Human Blood	Interstate Blood Bank		Store at 4oC.