의 발현에 대한 헬라 세포를 기반으로 무료 발현 시스템<em> 변형체</em> Rhoptry 단백질
Summary
셀 기반 시스템에서 말라리아 단백질의 발현은 도전 남아있다. 우리는 HeLa 세포에서 말라리아 재조합 rhoptry 단백질을 표현하는 두 단계 및 (체외 번역) 한 단계 IVT 세포 무료 발현 시스템을 보여줍니다. 우리 rhoptry 단백질을 정제하는 니켈 계 수지 친화 정제 시스템을 사용한다.
Abstract
말라리아는 중요한 글로벌 이환율과 사망률을 발생합니다. 어떤 일상적인 백신은 현재 사용할 수 없습니다. 백신의 부족에 대한 주요한 이유 중 하나는 적합한 백신 후보를 식별하는 도전이다. 말라리아 단백질은 원핵 생물과 진핵 세포 기반 발현 시스템이 제대로 감소 면역 원성에 이르는 부적절한 폴딩, 일반적으로 불용성 당화 및 겪게된다 사용하여 표현. 밀 배아, 토끼 망상 적혈구 용 해물 및 대장균 파쇄 무 세포 발현 시스템은 현재 말라리아 단백질의 발현을 위해 사용된다. 그러나, 발현 시간과 단백질의 부적절한 당화의 길이는 여전히 과제로 남아. 우리는 "시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템"이라 헬라 계 무 세포 발현 시스템을 이용하여 시험 관내에서 변형체 단백질의 발현을 보여준다. 2 헬라 세포 기반 표현의 자유 시스템은 75 분, transcrib의 3 μL에서의 mRNA를 전사ED의 mRNA는 90 분에 단백질을 변환하기에 충분하다. 1 단계의 발현 시스템은 전사 및 번역에 결합 발현 시스템이고; 전사 및 공동 번역은 3 시간에 발생합니다. 프로세스는 추가적인 에너지를 제공하여 6 시간 동안 연장 될 수있다. 2 단계 발현 시스템에서 mRNA를 먼저 전사 된 후 단백질 발현을위한 번역, 혼합 하였다. 우리는 말라리아 단백질을 표현하는 방법에 대해 설명합니다; 소수성 PF3D7_0114100 마우어의 갈라진 – 2 트랜스 (PfMC-2TM) 단백질, 친수성 PF3D7_0925900 단백질 및 헬라 계 무 세포 발현 시스템을 이용하여 단백질을 함유 PF3D7_1361800 딜 반복. 단백질은 2 단계 및 1 단계 식 전략을 이용한 마이크로 부피로 표현된다. 친 화성 정제 방법이 또한 기재되어있는 시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템을 이용하여 발현 된 단백질의 25 μL를 정화한다. 단백질의 수율은 브래드 포드 분석에 의해 결정되고 표현정제 된 단백질은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인 될 수있다. 표현 재조합 단백질은 면역, 면역 분석 및 단백질 서열 분석에 사용될 수있다.
Introduction
말라리아 연구에서 원핵 또는 진핵 세포 기반 시스템을 사용하여 면역 원성 단백질의 발현 도전 남아있다. 변형체 게놈과 알 수없는 포스트 번역 메커니즘 14,7의 AT의 풍요 로움은 항체 생산 및 백신 연구에 적절하게 접어 면역 원성 단백질을 획득과 관련된 어려움에 기여한다. 대장균 등의 원핵 시스템은 재조합 단백질 발현을 위해 사용되어왔다. 원핵 생물 시스템은, 효과적인 저렴한 비용으로 재조합 단백질의 높은 수율을 생산 여러 클로닝 벡터를 가지고있다. E. 호스트 대장균 세포는 변형이 용이하고 신속하게 세포 성장. 그러나, 이러한 시스템은 원핵 아미노산 치환, 번역 후 변형, 봉입체 (24) 내의 오염, 제품 및 이종 재조합 단백질의 축적의 위험 부족 등 한계가있다.
안에Mehlin 등의 알에 의해 연구. (2006) 1000 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 표현 하였다. 발현 된 단백질의 약 7 %가 용해 (14)이었다. 관찰 불용성 유전자의 바이어스 특성 및 풍부한 게놈 14의 변형체로 이상적으로 사용되는 코돈 고주파 때문이다. 이 문제를 극복하기위한 대안적인 전략은 플라스미드 또는 희귀 코돈 또는 3 주파수 일치 코돈 인식의 tRNA를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 개발되었다. 비록 이러한 최적화를 수행 한 후, 단백질의 매우 작은 부분, 수용성 활성 면역 원성 및 14로 표현된다. 무 세포 발현 시스템은 리보솜, 개시 요인, 신장 요인 (번역 인자)의 tRNA 및 아미노 아실 tRNA의 합성 효소 등의 전사 및 번역에 필요한 모든 구성 요소가 포함되어 있습니다. 두 전사 및 번역 반응은 한 단계 절차 11,29에 결합된다. transcrimRNA의 적당량은 상이한 튜브 11,29 병진 기계와 함께 배양하기 전에 ption 반응 관에서 수행된다. 이러한 방법 변형체 SP. 단백질 발현에 성공하지만, 주요 단점은 약 22 시간이며 29 단백질 발현을위한 시간의 길이이다. 또한, 프로토콜들 (29)에 포함 용품의 고가 성분 제제에서 노동 집약적 파쇄의 제제와의 불일치는, 이러한 시스템은 얻기 어려운 만든다. 무 세포 발현 시스템의 개발을위한 연구의 주요 초점은 빠른 유전자 변형, 높은 농도 및 정직 해물 준비 1 빠른 수율 등의 요인에 따라 달라집니다.
효모, 포유 동물 세포주, 배큘로 바이러스 매개 된 발현 시스템, 테트라 하이 메나의 thermophilia, Dictyostelium의 discoideum 기생 발현 시스템 SU 진핵 시스템리 슈만 편모충 같은 CH 재조합 단백질 발현 7에 사용되어왔다. 진핵 시스템 계통 관계를 공유하고, 따라서 또한 글리코 실화, 아 실화, 이황화 결합 형성, 샤페론 상호 작용, 단백질 분해 및 서브 셀룰러 구획화 등의 특성을 공유한다. 진핵 생물의 단백질 분비 이벤트는 축적을 방지하고 발현 시스템 (13)에 대한 독성을 감소시킨다. 그들은 대규모 단백질 발현 및 높은 수율을 얻는 4에 적합한 효모 시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 두 P. 원충의 단백질 PfCP-29과 Pvs25는 효모 시스템 (4)를 사용하여 제작되었다. 그러나, 대부분의 단백질의 합성에 중요한 결점이 불규칙 N과 O 글리코 실화 패턴, 부적절한 폴딩과 그 나라의 형태 4에서 단백질을 절단했다.
재조합 단백질의 합성을위한 포유 동물 세포의 사용은 노동 집약적이며 expen되고안정적인 재조합 세포주 4 유지 시브. 따라서, 포유 동물 세포는 단백질 시그널링 단백질 상호 작용 및 기생충 호스트 상호 작용 분석을 위해 한정되고, 또한 DNA 백신 4를 테스트. 본원에 기술 된 인간 DNA와 mRNA의 생체 외 단백질 발현 무 세포계는 3 시간에 단백질을 발현하는 헬라 세포 유래 포유류 기반 시스템이다. 단백질 식별 및 정화를 촉진 C- 말단 태그를 pT7CFE1-cHis 발현 벡터를 사용하여 표현했다. 헬라 기반 시스템함으로써 번역 시스템의 효율 향상, 번역 개시 인자 및 번역 조절로 보충된다. 단백질은 빠르게 번역 스크리닝 검증 및 다양한 면역 및 구조 (15) 애플리케이션에서 사용하기 위해 처리 될 수있다.
밀 배아와 토끼 망상과 같은 진핵 세포 – 표현의 자유 시스템은 현재 VAR의 표현에 사용되는변형체 단백질 11,29 포함 빚을내는 진핵 세포 단백질. 또한, E. 대장균 계 무 세포 시스템은 또한 진핵 단백질 발현을 위해 사용된다 (11). 표 1은 시스템의 기능뿐만 아니라 단백질 발현 시스템을 사용의 용이성을 비교함으로써 다른 무 세포 발현 시스템을 요약 한 것이다. 다른 사람들에 비해 인간의 무 세포계 포스트 공동 번역 후 변형을 수행 할 수있는 능력을 보유하고 덜 비싸다. 코돈 최적화가 가능하며, 모든 반응은 3 시간으로 수행 될 수있다. 헬라 시스템은 실험실 설정에서 단백질 합성을위한 번역 시스템에 이상적이다.
다른 무 세포 시스템에 비해 인간의 무 세포 발현 시스템의 큰 장점은 다른 기관 및 조직에서 유래 된 여러 세포주의 이용이다. 셀 무료 시스템의 여러 종류는 셀 라인에 따라 설계 할 수있다. 추출물포유 동물 세포 유래의 S는 다른 무 세포 발현 시스템보다 많은 단백질을 합성하기 위해 더 높은 효율을 갖는다. 이 무 세포 발현 시스템은 또한 마이크로 어레이 (30)로 진단 및 단백질 특성 애플리케이션에 사용될 수있다. 인기 인 HeLa 세포주는 가장 널리 단백질 33의 발현을 수행하기 위해 사용된다. 된 HeLa 세포주에서 소포체는 번역 후 변형 글리코 실화 활성 (33)의 부재를 초래 낙후이다. 그러나,이 시스템은 또한 글리코 실화 변형체 포스트 번역 변형 29 부족으로 변형체 단백질 합성에 유리할 것으로 생각된다. 헬라 세포 자유로운 전사 번역 프로토콜 저렴 수행하기 쉬운 단백질 정제 및 하류 어플리케이션을위한 준비, 90 분으로 표현 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
체외 인간 세포 무료 발현 시스템 및 정제에 두 단계를 사용하여 단백질을 성공적으로 표현 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 성공적으로 증폭 및 pT7CFE-CHis 플라스미드 벡터로 유전자의 복제; 2) 30 ℃로 RNA를 전사; 의 RNAse 억제제의 존재하에 30 ℃에서 단백질 3) 번역; 4) 폴리 클로 날 및 모노클로 날 항체를 사용하여 수지 Ni 및 5로 코팅 된 비드)에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 이용하여 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.
Materials
| Two-step in vitro human cell free expression system | Thermo fischer | 88856 | Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| One-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at room temperature |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4oC. |
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