Системы HeLa основе сотового свободное выражение для выражения<em> Плазмодий</em> Rhoptry Белки
Summary
Выражение малярийных белков в клеточных системах на основе остается сложной. Мы демонстрируем две системы шаг и один шаг IVT (в пробирке перевод) бесплатно экспрессии клеток для выражения малярийных рекомбинантных белков rhoptry из HeLa клеток. Мы используем систему очистки на основе Ni-смолы сродства для очистки rhoptry белки.
Abstract
Малярия вызывает серьезную глобальную заболеваемости и смертности. Нет дня вакцина не доступна в данный момент. Один из главных причин, из-за отсутствия вакцины задача выявления подходящих кандидатов вакцины. Малярийные белки выражается с помощью прокариотических и эукариотических систем экспрессии клеток на основе плохо гликозилирован, как правило, нерастворимы и пройти ненадлежащее складывание приводит к снижению иммуногенности. Свободные системы экспрессии зародышей пшеницы, лизата ретикулоцитов кролика и кишечная палочка лизат клеток в настоящее время используются для выражения малярийных белков. Однако продолжительность времени экспрессии и неправильного гликозилирования белков до сих пор остается проблемой. Мы демонстрируем выражение Plasmodium белков в пробирке с помощью системы свободного выражения клеток HeLa основе их называют "сотовые системы экспрессии бесплатно в пробирке человека". Свободные системы экспрессии клеток HeLa основе 2 транскрипции мРНК в 75 мин и 3 мкл transcribред мРНК достаточно, чтобы перевести белки в течение 90 мин. Система 1-шаг выражение транскрипции и трансляции системы в сочетании выражение; транскрипция и со-перевод происходит в 3 ч. Этот процесс также может быть расширен в течение 6 ч, обеспечивая дополнительную энергию. В системе 2-ступенчатой экспрессии мРНК сначала транскрибируется, а затем добавить в смесь перевода для экспрессии белка. Мы опишем, как выразить малярии белки; гидрофобный Волчья PF3D7_0114100 Маурера – 2 трансмембранный (PFMC-2TM) белок, белок гидрофильный PF3D7_0925900 и броненосец повторы, содержащие белок PF3D7_1361800, использующие систему свободного выражения клеток HeLa основе. Белки выражается в микро объемов использующих 2-ступенчатые и 1-шаг стратегии экспрессии. Метод аффинной очистки, чтобы очистить 25 мкл белков, выраженных с использованием человеческих клеток системы свободного выражения в пробирке также описаны. Выход белка определяется анализом Брэдфорда и выразили очищенные белки могут быть подтверждены с помощью анализа вестерн-блоттинга. Выраженные рекомбинантные белки могут быть использованы для иммунизации иммунологических и секвенирования белка.
Introduction
В малярией исследования, выражение иммуногенных белков с использованием прокариотических или эукариотических систем, основанных клеток остается проблемой. НА богатство Plasmodium геноме и неизвестных посттрансляционных механизмов 14,7, способствуют трудности, связанные с получением правильно сложенные и иммуногенные белки для производства антител и вакцин исследований. Прокариотических системах, таких как кишечной палочки были использованы для экспрессии рекомбинантного белка. Прокариотических системах являются низкая стоимость, эффективный, высокие урожаи рекомбинантного белка и имеют несколько векторов клонирования. Принимающая Е. палочки клетки легко трансформировать и клетки быстро расти. Тем не менее, прокариотические системы имеют ограничения, такие как отсутствие замещения аминокислоты, посттрансляционной модификации, риск загрязнения, гетерогенных продуктов и накопления рекомбинантных белков в тельцах включения 24.
ВИсследование Mehlin др. (2006), были выражены 1000 открытые рамки считывания (ORF). Примерно 7% выраженных белков растворяются 14. Нерастворимость наблюдается из-за смещенного природы генов и высокой частоты кодонов, которые используются в идеале от Plasmodium у богатых генома 14. Альтернативная стратегия для преодоления этой проблемы была разработана с помощью плазмиды или клеток-хозяев, содержащих тРНК, которые распознают редкие кодоны или кодоны, которые соответствуют частоты 3. Даже после выполнения этих оптимизацию, очень небольшие порции белков выражены как растворима активна и иммуногенной 14. Системы экспрессии бесклеточные содержать все компоненты, необходимые для транскрипции и трансляции, такие как рибосомы, факторы инициации, элонгации факторов (факторов) переводы, тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы. Обе реакции транскрипции и трансляции соединены в один шаг процедуры 11,29. TranscriРеакция автомеханик выполняется в трубе, прежде чем соответствующее количество мРНК инкубировали с перевода техники в другом трубки 11,29. Хотя эти методы являются успешными в Plasmodium Sp. Экспрессии белка, основным недостатком является продолжительность времени для экспрессии белка, который составляет примерно 22 ч 29. Кроме того, высокая стоимость расходных материалов для включения в протоколы 29, трудоемких препараты клеточного лизата и несоответствия в компонент препаратов, сделать эти системы недостижима. Основное внимание исследователей для развития свободной системы экспрессии клеток зависит от таких факторов, как быстрое генетической модификации, быстрых выходов с высокой концентрацией и прямо вперед лизатов препаратов 1.
Эукариотических системах, таких как дрожжи, клеточные линии млекопитающих, бакуловируса опосредованной системы экспрессии, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum и паразитарных системах экспрессии суч в Leishmania были использованы для экспрессии рекомбинантного белка 7. Эукариотических системах поделиться филогенетическое родство и, следовательно, общие характеристики, такие как гликозилирование, ацилирование, образование дисульфида облигаций, шаперонной взаимодействия, протеолиза и субклеточном раздробленности. Белковые секреции события в эукариот предотвратить накопление и уменьшается токсичность для систем экспрессии 13. Применение дрожжей систем является предпочтительным, поскольку они пригодны для экспрессии белка в большом масштабе и для получения высоких урожаев 4. Два П. тропической белки PFCP-29 и Pvs25 были произведены с использованием системы дрожжей 4. Тем не менее, основным недостатком в синтезе большинства белков нерегулярные N и О-гликозилирования узоры, неадекватное складывания и усечение белков из их родной форме 4.
Использование клеток млекопитающих для синтеза рекомбинантных белков является трудоемким, и это expenSive для поддержания стабильных рекомбинантных клеточных линий 4. Таким образом, клетки млекопитающих были ограничены для анализа сигналов белка, белковых взаимодействий и паразит-хозяин взаимодействий, а также для тестирования вакцин ДНК 4. ДНК человека и РНК в пробирке бесклеточной системе экспрессии белка, описанный здесь, млекопитающих система на основе клеток, полученных HeLa, что выражает белки в 3 ч. Белки выражается с помощью pT7CFE1-Chis вектор экспрессии имеют C-концевой метки облегчая идентификацию и очистку. Система основана HeLa дополнена факторов инициации трансляции и регулятора перевода, тем самым повышая эффективность системы перевода. Белки могут быть быстро переведен, экранированный, проверены и обработаны для использования в различных иммунологических и конструкционных применений 15.
Эукариотических системах экспрессии клеток-Free, такие как зародыши пшеницы и ретикулоцитов кролика в настоящее время используется для выражения Varдолговые расписки эукариот белки, включая белки Plasmodium 11,29. Кроме того, Е. Системы, основанные палочки бесклеточные также используются для выражения эукариотических белков 11. В таблице 1 приведены различные системы экспрессии клеток бесплатно, сравнивая особенности систем, а также простоту использования системы для экспрессии белка. Бесклеточной системе человеческого в сравнении с другими имеет возможность выполнять пост и ко-трансляционных модификаций и дешевле. Оптимизация кодонов можно и все эти реакции могут быть осуществлены в 3 ч. Система HeLa является идеальной системой перевод синтеза белка в лабораторных условиях.
Основным преимуществом систем экспрессии клеток человека свободным по сравнению с другими свободными системами клеток является наличие нескольких различных клеточных линий, полученных из различных органов и тканей. Несколько разновидностей свободных клеточных системах могут быть разработаны в зависимости от клеточной линии. Экстрактс, полученные из клеток млекопитающих имеют более высокую эффективность, чтобы синтезировать большие белки, чем любых других системах экспрессии клеток бесплатно. Эти системы экспрессии клеток свободным и может быть использован в диагностических и белковых приложений характеризации таких как микро наборов 30. Популярные клеточные линии HeLa наиболее широко используются для проведения экспрессию белков 33. Эндоплазматическая сеть в клеточных линиях HeLa недоразвита, что приводит к отсутствию посттрансляционная гликозилирования модификации активности 33. Тем не менее, эта система, как полагают, чтобы быть выгодным для синтеза белка Plasmodium, как плазмодий также не гликозилирования после модификации перевода 29. Свободный протокол транскрипции-трансляции HeLa клетки легко выполнить, недорогой и белки могут быть экспрессированы в течение 90 мин, готова для очистки и далее вниз по течению приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важные шаги для успешного экспрессии белков с использованием двух шаг в пробирке свободного системы экспрессии клеток человека и очистки: 1) успешной амплификации и клонированию генов в pT7CFE-Chis плазмидного вектора; 2) расшифровки РНК на 30 ° С; 3) перевод белка при 30 ° С в присутствии ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.
Materials
| Two-step in vitro human cell free expression system | Thermo fischer | 88856 | Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| One-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at room temperature |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4oC. |
Referências
- Alexandrov, K., et al. Leishmania. cell-free expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
- Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
- Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
- Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
- Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
- Gowda, D. C., Davidson, E. A. Protein glycosylation in the malaria parasite. Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
- Hinnebusch, A. . Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).
- Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
- Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
- Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
- Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
- Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
- Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
- Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
- Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
- Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
- Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
- Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
- Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
- Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. Rhop-3 protein conservation among Plasmodium. species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).
- Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
- Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
