Sistemas basados en células HeLa Expresión Libre de Expresión de<em> Plasmodium</em> rhoptry Proteínas
Summary
La expresión de proteínas de la malaria en sistemas basados en células sigue siendo un reto. Demostramos dos sistemas de libre expresión de células de paso y un paso IVT (en la traducción in vitro) para expresar proteínas recombinantes rhoptry malaria a partir de células HeLa. Utilizamos un sistema de purificación basado en la afinidad de Ni-resina para purificar las proteínas rhoptry.
Abstract
La malaria causa de morbilidad y mortalidad global significativo. Ninguna vacuna rutinaria está disponible actualmente. Una de las principales razones de la falta de una vacuna es el reto de identificar candidatos vacunales adecuados. Proteínas palúdicas expresan utilizando sistemas de expresión procariotas y eucariotas basados en células están mal glicosilados, generalmente insolubles y se someten plegado inadecuada conduce a una inmunogenicidad reducida. Los sistemas de expresión libres de germen de trigo, lisado de reticulocitos de conejo y Escherichia coli lisado de células se utilizan actualmente para la expresión de las proteínas de la malaria. Sin embargo, la longitud de tiempo expresión y glicosilación inadecuada de proteínas sigue siendo un desafío. Demostramos la expresión de proteínas de Plasmodium in vitro utilizando sistemas de libre expresión basados en células HeLa, denominados "sistemas de expresión in vitro de células humanas libres". Los sistemas de la libre expresión basados en células HeLa 2 transcriben mRNA en 75 min y 3 l de transcribed mRNA es suficiente para traducir proteínas en 90 min. El sistema de expresión 1-paso es una transcripción y traducción acoplada sistema de expresión; la transcripción y co-traducción se produce en 3 horas. El proceso también se puede extender durante 6 horas al proporcionar energía adicional. En el sistema de expresión de 2 a paso, el ARNm se transcribe primero y después se añadió a la mezcla de traducción de la expresión de la proteína. Describimos cómo expresar proteínas de la malaria; un hidrófobo Acantilado de PF3D7_0114100 Maurer – 2 proteína transmembrana (PFMC-2 ™), una proteína PF3D7_0925900 hidrófilo y un repeticiones armadillo que contienen proteínas PF3D7_1361800, utilizando el sistema de expresión libre de células HeLa basado. Las proteínas se expresan en micro volúmenes que emplean estrategias de expresión de 2 pasos y 1 pasos. Un método de purificación de afinidad para purificar 25 l de proteínas expresadas mediante el sistema de libre expresión in vitro de células humanas también se describe. Rendimiento de proteína se determina mediante el ensayo de Bradford y la expresóy proteínas purificadas se pueden confirmar por análisis de Western Blot. Proteínas recombinantes expresadas se pueden utilizar para inmunizaciones, inmunoensayos y secuenciación de proteínas.
Introduction
En la investigación de la malaria, la expresión de proteínas inmunogénicas utilizando sistemas basados en células procariotas o eucariotas sigue siendo un reto. La riqueza AT del genoma de Plasmodium y los mecanismos de post traduccionales desconocidos 14,7, contribuyen a las dificultades asociadas a la obtención de proteínas correctamente plegadas y inmunogénicas para los estudios de producción de anticuerpos y vacunas. Sistemas procariotas tales como Escherichia coli se han utilizado para la expresión de proteína recombinante. Sistemas procariotas son de bajo costo, eficaces, producen altos rendimientos de proteína recombinante y tienen múltiples vectores de clonación. Anfitrión E. coli células son fáciles de transformar y células crecen rápidamente. Sin embargo, los sistemas procariotas tienen limitaciones tales como la falta de sustitución de aminoácidos, modificación post-traduccional, riesgo de contaminación, productos heterogéneos y acumulación de proteínas recombinantes dentro de cuerpos de inclusión 24.
En unestudio de Mehlin et al (2006)., 1000 marcos de lectura abierta (ORF) se expresaron. Aproximadamente el 7% de las proteínas expresadas eran soluble 14. La insolubilidad observado es debido a la naturaleza sesgada de los genes y la alta frecuencia de los codones que se utilizan idealmente por el Plasmodium rica en AT del genoma 14. Una estrategia alternativa para superar este problema se ha desarrollado mediante el uso de plásmidos o células huésped que contienen tRNAs que reconocen codones o codones que coincidan con las frecuencias 3 raras. Incluso después de realizar estas optimizaciones, porciones muy pequeñas de proteínas se expresan como soluble, activo e inmunogénica 14. Los sistemas de expresión sin células contienen todos los componentes necesarios para la transcripción y la traducción, tales como ribosomas, factores de iniciación, factores de elongación (traducciones factores), tRNA y aminoacil-tRNA sintetasas. Ambas reacciones de transcripción y traducción se acoplan en el procedimiento de un solo paso 11,29. El transcription reacción se realiza en un tubo antes de cantidad apropiada de mRNA se incuba con maquinaria de traducción en un 11,29 tubo diferente. Aunque estos métodos tienen éxito en Plasmodium sp. Expresión de proteínas, un inconveniente importante es la longitud de tiempo para la expresión de la proteína, que es aproximadamente 22 hr 29. Además, el alto costo de los suministros para su inclusión en los protocolos 29, los preparativos de trabajo intensivo del lisado celular e inconsistencias en los preparativos de los componentes, hacen de estos sistemas inalcanzable. El objetivo principal de los investigadores para el desarrollo de un sistema de expresión libre de células depende de factores tales como la modificación genética rápida, los rendimientos rápidos con altas concentraciones y preparaciones de lisado adelante rectas 1.
Sistemas eucariotas como las levaduras, las líneas celulares de mamíferos, baculovirus sistema de expresión mediada, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum y sistemas de expresión parasitarias Doch como Leishmania se han utilizado para la expresión de proteína recombinante 7. Sistemas eucariotas comparten relación filogenética y por lo tanto también comparten características como la glicosilación, acilación, la formación de enlaces disulfuro, la interacción chaperona, la proteolisis y la compartimentación subcelular. Eventos secreción de proteínas en eucariotas evitar la acumulación y disminuye la toxicidad para los sistemas de expresión 13. Se prefiere el uso de sistemas de levadura, ya que son adecuados para la expresión de proteínas en gran escala y para la obtención de altos rendimientos 4. Dos P. proteínas falciparum PFCP-29 y Pvs25 se produjeron utilizando el sistema de levadura 4. Sin embargo, un inconveniente importante en la síntesis de la mayoría de las proteínas era patrones irregulares de N y O-glicosilación, plegado y truncamiento de proteínas a partir de su forma nativa 4 inadecuada.
El uso de células de mamíferos para la síntesis de proteínas recombinantes es un trabajo intensivo y se Expensive para mantener las líneas celulares recombinantes estables 4. Por lo tanto, las células de mamíferos se han limitado para el análisis de señalización de la proteína, interacciones proteína y las interacciones parásito-huésped y también para el ensayo de vacunas de ADN 4. El ADN humano y vitro sistema libre de células mRNA pt la expresión de proteínas se describe en el presente documento es un sistema de base de mamífero derivado de células HeLa que expresa las proteínas en 3 hr. Las proteínas expresadas utilizando vector de expresión pT7CFE1-Chis haber una etiqueta C-terminal de facilitar la identificación y purificación. El sistema basado en HeLa se complementa con factores de iniciación de la traducción y un regulador de la traducción, mejorando así la eficiencia del sistema de traducción. Las proteínas se pueden traducir rápidamente, examinados, verificados y procesados para su uso en diversas aplicaciones inmunológicas y estructurales 15.
Los sistemas de expresión libres de células eucariotas tales como germen de trigo y de reticulocitos de conejo se utilizan actualmente para la expresión de varproteínas eucariotas pagarés incluyendo proteínas de Plasmodium 11,29. Además, E. sistemas libres de células basados coli también se emplean para la expresión de la proteína eucariota 11. La Tabla 1 resume los diferentes sistemas de expresión libre de células mediante la comparación de características de los sistemas, así como la facilidad de uso de los sistemas para la expresión de proteínas. El sistema libre de células humana en comparación con los otros tiene la capacidad de realizar modificaciones post y co-traduccional y es menos costoso. La optimización de codones es posible y todas las reacciones se puede realizar en 3 hr. El sistema de HeLa es un sistema de traducción ideal para la síntesis de proteínas en el entorno de laboratorio.
Una ventaja importante de los sistemas de expresión libre de células humanas sobre otros sistemas libres de células es la disponibilidad de varias líneas celulares diferentes derivadas de diferentes órganos y tejidos. Varias variedades de sistemas libres de células pueden ser diseñados dependiendo de la línea celular. El extracto des derivados de células de mamíferos tienen una mayor eficiencia para sintetizar proteínas grandes que cualquier otro sistema de expresión libre de células. Estos sistemas de expresión de células libres también se pueden utilizar en aplicaciones de diagnóstico y caracterización de proteínas tales como micro matrices 30. Los populares líneas celulares HeLa son los más ampliamente utilizados para llevar a cabo la expresión de proteínas 33. El retículo endoplasmático en las líneas celulares HeLa es subdesarrollado, que conduce a la ausencia de actividad de modificación de la glicosilación post-traduccional 33. Sin embargo, se cree que este sistema a ser ventajoso para la síntesis de proteínas Plasmodium como Plasmodium también carece de modificación posterior a la traducción de glicosilación 29. El protocolo libre de transcripción-traducción de células HeLa es fácil de realizar, de bajo costo y las proteínas se puede expresar en 90 min, listo para la purificación y otras aplicaciones posteriores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos importantes para la expresión con éxito de proteínas usando dos etapas en el sistema libre de células humanas in vitro la expresión y purificación son: 1) la amplificación y clonación de genes en pT7CFE-CHIS plásmido vector éxito; 2) la transcripción de ARN a 30 ° C; 3) la traducción de proteína a 30 ° C en presencia de inhibidor de RNasa; 4) el desarrollo del protocolo de purificación de afinidad basada usando perlas de resina recubiertas con Ni y 5) el análisis de resultados en we…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.
Materials
| Two-step in vitro human cell free expression system | Thermo fischer | 88856 | Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| One-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at room temperature |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4oC. |
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