To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
الكبد لديه قدرة كبيرة على التجدد. خلايا الكبد، والخلايا متني من الكبد، ويمكن تجديد في واحدة من طريقتين: hepatocyte- أو يحركها المرارة تجديد الكبد. في يحركها الكبدية تجديد الكبد، وتستمد خلايا الكبد تجديد خلايا الكبد من قبل الإيجاد، في حين أنه في يحركها المرارة تجديد، تستمد خلايا الكبد تجديد من الخلايا الظهارية الصفراوية (BECS). ليحركها الكبدية تجديد الكبد، وهناك نماذج القوارض الممتازة التي ساهمت إلى حد كبير في الفهم الحالي لتجديد الكبد. ومع ذلك، لا يوجد نموذج القوارض مثل هذا ليحركها المرارة تجديد الكبد. بلغنا مؤخرا على نموذج اصابة الكبد الزرد التي BECS إعطاء نطاق واسع أدى إلى خلايا الكبد عند فقدان الكبدية الحادة. في هذا النموذج، وذاب خلايا الكبد بشكل خاص من قبل وسائل pharmacogenetic. هنا نقدم بالتفصيل الطرق لاجتثاث خلايا الكبد وتحليل عملية تجديد الكبد BEC يحركها.هذا النموذج الاجتثاث الكبدية محددة يمكن أن تستخدم أيضا لاكتشاف الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء يحركها المرارة تجديد الكبد. وعلاوة على ذلك، وهذه الأساليب يمكن تطبيقها على شاشات الكيميائية لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تزيد أو قمع تجديد الكبد.
الكبد هو عضو التجديدي للغاية. خلال تجديد الكبد، وتجديد خلايا الكبد، والخلايا متني من الكبد، وتستمد من خلايا الكبد موجود مسبقا (يحركها الكبدية تجديد الكبد) أو BECS (يحركها المرارة تجديد الكبد) 1،2. اصابة الكبد عادة ما يتسبب في انتشار خلايا الكبد موجودة من قبل؛ ومع ذلك، عندما تتعرض للخطر الانتشار الكبدية، BECS يمكن أن تسهم في خلايا الكبد 2-4. هذين الوضعين لتجديد الكبد هامة سريريا. على الاستئصال الجراحي لجزء من الكبد البشري (على سبيل المثال، بسبب أورام الكبد أو المتبرعين الأحياء)، خلايا الكبد في الكبد المتبقية تتكاثر لاسترداد كتلة الكبد المفقودة. على النقيض من ذلك، في المرضى الذين يعانون من أمراض في الكبد، وخطر انتشار خلايا الكبد إلى حد كبير، بحيث تظهر BECS أو الخلايا الاولية الكبد (LPCs) للمساهمة في تجديد خلايا الكبد 5،6. نموذج استئصال الكبد الجزئي القوارض 2/3، والذيخلايا الكبد تتكاثر لاسترداد كتلة الكبد المفقودة، ساهمت إلى حد كبير في الفهم الحالي يحركها الكبدية الكبد تجديد 7،8. ومع ذلك، لا يوجد نموذج والقوارض صالح في والتي هي مستمدة أساسا خلايا الكبد تجديد من BECS. على الرغم من أن العديد من النماذج سموم الكبد القوارض أدى إلى تحديد يحركها المرارة الكبد تجديد 2-4، النسب تتبع الدراسات التي أجريت مؤخرا على الفئران تشير إلى مساهمة الحد الأدنى من BECS لتجديد خلايا الكبد في هذه النماذج 9،10. بعض النماذج اصابة الكبد القوارض، بما في ذلك استئصال الكبد الجزئي 11-13 والتي يسببها الأسيتامينوفين تلف الكبد 14،15، تم تطبيقها على الزرد وأدت إلى تحديد جينات جديدة أو مسارات المتورطين في تجديد الكبد. ومع ذلك، مدفوعة الكبدية، ولكن ليس BEC يحركها، يحدث تجديد الكبد في هذه النماذج اصابة الكبد الزرد. ولذلك، فإن نموذج إصابة الكبد الرواية التي BECS تساهم نطاق واسع لregeneratخلايا الكبد جي هو مطلوب من أجل فهم أفضل للBEC يحركها تجديد الكبد.
ووصفت الأهداف العامة للنموذج الاجتثاث الكبدية هنا (1) لإنشاء نموذج اصابة الكبد التي BECS المساهمة على نطاق واسع في خلايا الكبد تجديد، و (2) توضيح الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة BEC يحركها تجديد الكبد. افترضنا أن شدة الإصابة تحدد طريقة تجديد الكبد. وبالتالي، توقعنا أن يحركها المرارة تجديد الكبد ستشرع على الإصابة الكبدية الحادة. لاختبار هذه الفرضية، قمنا بتطوير نموذج إصابة الكبد الزرد عن طريق توليد خط المعدلة وراثيا، تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) s931، التي تعبر عن درجة عالية من Nitroreductase بكتيريا (NTR) تنصهر مع بروتين فلوري سماوي (CFP) تحت fabp10a الكبدية محددة المروج. منذ NTR يحول دواء مساعد غير سامة، ميترونيدازول (Mtz ل)، إلى المخدرات السامة للخلايا، فإنه ablates فقط يقصد NTR-معربا عن الخلايا 16-18، في هذه الحالة، وخلايا الكبد. عن طريق التلاعب في مدة العلاج MTZ، مدى الكبدية الاجتثاث يمكن السيطرة عليها. باستخدام هذا النموذج، ونحن ذكرت مؤخرا ان على فقدان الكبدية الحادة، BECS إعطاء نطاق واسع أدى إلى تجديد خلايا الكبد 19، وهو ما أكده أيضا من قبل اثنين من دراسات أخرى مستقلة 20،21. وبالتالي، مقارنة مع القوارض المذكور ونماذج إصابة الكبد الزرد، لدينا الكبدية نموذج الاجتثاث هو أكثر فائدة لدراسة BEC يحركها تجديد الكبد.
يصف هذا البروتوكول إجراءات إجراء التجارب تجديد الكبد باستخدام الزرد نموذج الكبدية الاجتثاث. وهذا النموذج سوف يكون مناسبا لتحديد الآليات الكامنة وراء يحركها المرارة تجديد الكبد وللشاشات الكيميائية لتحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن تقمع أو زيادة تجديد الكبد.
شديدة، ولكن ليس خفيفة، الكبدية الاجتثاث يثير يحركها المرارة تجديد الكبد. لذلك، بعد العلاج Mtz لوفشل، فمن المهم أن تدرس حجم الكبد من اليرقات Mtz لمعاملتهم، والتي يمكن تقييمها من قبل لا يتجزأ CFP مضان من fabp10a: CFP-NTR التحوير. لأن نسبة صغيرة من اليرقات Mtz لمعاملة سيعرض غير ?…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |