Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em> Streptococcus iniae</em> Infektions
Summary
Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.
Abstract
Die aquatische Erreger Streptococcus iniae, ist seit mehr als 100 Millionen Dollar in jährlichen Verluste für die Aquakultur zuständig und in der Lage ist, die systemische Erkrankung in beiden Fische und Menschen. Ein besseres Verständnis der S. iniae Pathogenese der Erkrankung erfordert eine entsprechende Modellsystem. Die genetische Lenkbarkeit und die optische Transparenz der frühen Entwicklungsstadien von Zebrabärbling ermöglichen die Erzeugung und nicht-invasive Abbildung von transgenen Linien mit fluoreszenzmarkierten Immunzellen. Das adaptive Immunsystem nicht voll funktionsfähig, bis mehrere Wochen nach der Befruchtung, aber Zebrafisch-Larven haben eine konservierte Wirbel angeborenen Immunsystems mit beiden Neutrophilen und Makrophagen. Somit ist die Erzeugung eines Larveninfektionsmodell ermöglicht die Untersuchung des spezifischen Beitrags der angeborenen Immunität bei der Kontrolle S. iniae Infektion.
Die Website der Mikroinjektion wird geprüft, ob eine Infektionsystemische oder zunächst lokalisiert. Hier präsentieren wir unsere Protokolle für Ohrbläschen Injektion von Zebrafisch im Alter von 2-3 Tagen nach der Befruchtung sowie unsere Methoden zur Fluoreszenz konfokale Abbildung der Infektion. Eine lokalisierte Infektion Website ermöglicht die Beobachtung der ersten Mikroben-Invasion, Rekrutierung von Wirtszellen und die Verbreitung der Infektion. Unsere Ergebnisse unter Verwendung des Zebrafisch-Larven-Modell von S. iniae Infektion zeigen, daß Zebrafisch kann verwendet werden, um die unterschiedlichen Beiträge von Aufnahme Neutrophilen und Makrophagen in lokalisierten bakteriellen Infektionen zu untersuchen. Darüber hinaus wird beschrieben, wie Photomarkierung von Immunzellen können einzelne Wirtszelle Schicksal im Verlauf der Infektion zu verfolgen.
Introduction
Streptococcus iniae ist ein großer Wasserkrankheitserreger, der in der Lage ist, die systemische Krankheiten bei den Fischen und Menschen 1 ist. Während S. iniae ist für große Verluste in der Aquakultur-Industrie zuständig ist, ist es auch ein Potenzial Zoonoseerreger, der Lage verursacht Erkrankung bei immun menschlichen Wirten mit klinischen Erkrankungen ähnlich denen von anderen Streptokokken menschlichen Erregern verwendet wird. Aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit menschlicher Krankheitserreger, ist es wichtig, S. studieren iniae Pathogenese der Erkrankung in Zusammenhang mit einem natürlichen Wirt. Ein erwachsenen Zebrafisch-Modell von S. iniae Infektion ergab, robust Infiltration von Leukozyten an das Host-lokalisierten Ort der Infektion sowie eine schnelle Zeit bis zum Tod Gastgeber, eine Zeit zu kurz, um das adaptive Immunsystem 7 einzubeziehen. Um zu gewinnen eine eingehende in der angeborenen Immunantwort auf S. betrachten iniae Infektion in vivo ist es erforderlich, ein Modell zu zugänglicher n verwendenon-invasive Echtzeit-Bildgebung.
Die Larven Zebrafisch hat eine Reihe von Vorteilen, die es immer attraktiver Wirbeltiermodell zur Untersuchung Wirt-Pathogen-Interaktionen zu machen. Zebrafische sind relativ preiswert und einfach zu bedienen und zu halten im Vergleich zu Säugermodellen. Adaptive Immunität ist nicht funktionell reifen, bis 4-6 Wochen nach der Befruchtung, aber Larven haben eine hoch konservierte Wirbel angeborenen Immunsystems mit Ergänzung, Toll-like Rezeptoren, Zytokine und Neutrophilen und Makrophagen, die mit antimikrobiellen Funktionen, einschließlich Phagozytose und Respiratory Burst 2-6, 8-11. Darüber hinaus ist die genetische Lenkbarkeit und der optischen Transparenz der embryonalen und larvalen Stadien der Entwicklung ermöglichen die Erzeugung von stabilen transgenen Linien mit fluoreszenzmarkierten Immunzellen macht es möglich, Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen in Echtzeit in vivo zu untersuchen. Die Erzeugung dieser transgenen Linien mit einem Photokonvertierbare Protein wie Dendra2 ermöglicht die Verfolgung einzelner Wirtszelle Herkunft und Schicksal im Laufe der Infektion 12.
Bei der Entwicklung eines Zebrafisch-Larven-Infektionsmodell, wird der gewählte Standort der Mikroinjektion Feststellung der Infektion zunächst lokal oder systemisch. Der systemische Blutinfektionen in die Schwanzvene oder Duct von Cuvier werden am häufigsten verwendet, um mikrobielle Krankheitserreger im Zebrafisch zu untersuchen und sind nützlich für das Studium Interaktionen zwischen Wirt und mikrobiellen Zellen, Zytokin-Antworten, und die Unterschiede in der Virulenz zwischen Erregerstämme. Für langsamere Wachstum von Mikroorganismen kann eine frühe Einspritzung in den Dottersack von Embryos im 16-1,000 Zellstadium für die Mikroinjektion eines langsam wachsenden Mikroorganismus gefunden, zwischen werden verwendet werden, um eine systemische Infektion 13,14 zu erzeugen, mit der optimalen Entwicklungsstadium die 16 bis 128 Zellstadium 15. Allerdings Dottersack Injektionen von vielen Mikroben in späteren Phasen der Entwicklung sind in der Regel tödlich Host zu t zu seiner aufgrund Gastgeber an den nährstoffreichen Umgebung für Mikroben und der Mangel an infiltrierenden Leukozyten 16-18.
Eine lokalisierte Infektion führt in der Regel gerichtete Wanderung von Leukozyten in Richtung der Infektionsstelle, die leicht mit nicht-invasive Abbildungs quantifiziert werden kann. Diese Art der Infektion kann für die Präparation der Mechanismen, die Leukozyten-Migration sowie Untersuchung verschiedener Zugvögel und phagozytischen Funktionen verschiedener Leukozytenpopulationen vermitteln können. Lokalisierte Infektionen sind auch nützlich bei der Prüfung Unterschiede in der Virulenz zwischen Bakterienstämme sowie Studium Mikrobe Invasionsmechanismen seit physischen Host Barrieren müssen für eine lokalisierte Infektion gekreuzt systemischen zu werden werden. Zebrafische sind typischerweise bei Temperaturen von 25-31 ° C 19 angehoben wird, sie können aber auch bei Temperaturen von bis zu 34-35 ° C für die Untersuchung der Invasivität von bestimmten Pathogenen beim Menschen strengen Temperaturanforderungen aufrechterhalten werdenVirulenz 20, 21.
Viele verschiedene Standorte wurden verwendet, um eine anfänglich lokalisierten bakteriellen Infektionen, einschließlich der Hinterhirn Ventrikel 22, dorsalen Schwanzmuskel 18, Perikardhöhle 23 und Ohrbläschen (Ohr) 5, 16, 24 zu erzeugen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Injektion von Bakterien in den Ruten Muskel Gewebeschädigung und Entzündung unabhängig von den Bakterien, die bei der Untersuchung Leukozytenreaktion 13 Ergebnisse verzerren können verursachen gefunden. Obwohl weniger Schaden mit Injektion in die Hinterhirn verbunden, und obwohl es zunächst frei von Leukozyten in jungen Embryonen ist das Hinterhirn Ventrikel stetig gewinnt mehr Immunzellen im Laufe der Zeit als Mikroglia Wohnsitz zu nehmen. Das Hinterhirn Ventrikel ist auch ein schwieriger Ort zum Bild. Der Ohrbläschen ist ein geschlossener Hohlraum, ohne direkten Zugang zu dem Gefäßsystem 25, 26. Es ist in der Regel frei von leukocytes, aber Leukozyten an das Ohrbläschen als Antwort auf Entzündungsreize wie Infektion rekrutiert werden. Es ist auch ein bevorzugter Ort der Mikroinjektion von Bakterien in Zebrabärbling Alter von 2-3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) wegen der Einfachheit der Bildverarbeitung und die Visualisierung der Injektion. Daher haben wir uns für das Ohrbläschen wie unsere Website von lokalisierten bakteriellen Infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Infektion Verfahren verwendet hier ist nützlich für die Untersuchung der Immunantwort des Wirts zu einer anfänglich lokalisierten Infektion bei 2-3 dpf Embryonen und Larven. Der Fokus eines Entzündungsreiz, wie Infektion, in einem geschlossenen Hohlraum, wie der Ohrbläschen ermöglicht die Untersuchung von Neutrophilen und Makrophagen-Chemotaxis und Phagozytose. Eine Einschränkung des Injizierens von Bakterien in das Ohrbläschen ist, daß die Fähigkeit von Neutrophilen, effizient phagozytieren Bakterien in m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Labormitglieder für Zebrafisch Pflege und Wartung zu danken. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 EA Harvie und NIH R01GM074827 Anna Huttenlocher unterstützt.
Materials
| 1.7 ml eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x 1/2 in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96 well plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 mm x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
Referências
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
