Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.
La evaluación histológica de las biopsias musculares ha servido como una herramienta indispensable en la comprensión del desarrollo y la progresión de la patología de los trastornos neuromusculares. Sin embargo, con el fin de hacerlo, el cuidado apropiado debe ser tomado cuando la escisión y la preservación de los tejidos para lograr tinción óptimo. Uno de los métodos de conservación de tejidos implica la fijación de tejidos en formaldehído y luego incrustarlos con cera de parafina. Este método preserva la morfología bien y permite el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente pero es engorroso y requiere la manipulación de productos químicos tóxicos. Además, los resultados de fijación en formol antígeno entrecruzamiento, lo que requiere protocolos de recuperación de antígeno por inmunotinción eficaz. Por el contrario, seccionado congelado no requiere la fijación y por lo tanto retiene conformación antígeno biológica. Este método también proporciona una clara ventaja en vuelta rápida alrededor del tiempo, por lo que es especialmente útil en situaciones que requieren evaluación histológica rápida como intraoperaTIVE biopsias quirúrgicas. A continuación se describe el método más eficaz de preparar biopsias musculares para la visualización con diferentes tinciones histológicas e inmunológicas.
El examen de histología muscular juega un papel crítico en la comprensión de los diferentes tipos de trastornos neuromusculares 1-4. Cuando se combina con otras técnicas, permite a los investigadores para obtener una mejor idea de la manifestación y la progresión de la patología y también pueden ser esenciales para evaluar la eficacia de una intervención terapéutica 5-10. Sin embargo, para ser precisos, los tejidos necesitan ser conservado en la manera apropiada a fin de preservar el estado fisiológico inmediatamente antes de la escisión. Esto requiere gran cuidado durante la extracción, preservación, seccionamiento y tinción.
Los tejidos pueden prepararse de dos maneras diferentes para estudio microscópico de luz. El primer método, formol fija en parafina (FFPE) secciones, requiere tejidos que se fijaron en formaldehído al 10% tamponada naturales antes de ser integrado con cera de parafina 11,12. La etapa de fijación ayuda a preservar la morfología mejor, pero también vínculos transversales pr endógenaoteins necesitando por lo tanto los procedimientos de recuperación de antígeno intrincada de inmunotinción y eliminando la posibilidad de tinción enzimática en tales secciones 12. Las secciones congeladas, por otra parte, no tienen que ser pre-fijo o procesados; por lo tanto, las proteínas son capaces de retener conformaciones biológicos nativos 13,14. Además, las secciones congeladas también permiten el tiempo de respuesta rápida, que a veces es necesario, por ejemplo en el diagnóstico intraoperatorio de los sarcomas y otros biopsias quirúrgicas 15. Sin embargo, si no se hace correctamente, este método es propenso a los daños por congelación, que introduce cambios en la arquitectura muscular haciendo las secciones no aptos para el examen histológico. En este trabajo se expondrá el método más eficaz para preparar las biopsias musculares para lograr tinción óptimo para examen adecuado.
Histología e inmunohistoquímica se han utilizado como herramientas clave en la comprensión de la manifestación y la progresión de la patología en diversos trastornos neuromusculares. Clásicamente, las biopsias musculares se fijaron por primera vez en formaldehído y luego incrustados con cera de parafina. Si bien la fijación de formaldehído conserva la arquitectura del tejido y permite el almacenamiento y transporte del tejido a temperatura ambiente, también inactiva las enzimas y los entrecruzamientos proteí…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).
Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 Richard Allen Scientific |
Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Olympus |
Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Image J, Metamorph |
Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029 |
OCT | 4583 | Sakura Inc. | Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA Leica Microsystem |
Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 VWR Scientific |
Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |