이 프로토콜은 9 주 된 쥐의 branchiomeric 머리 근육에서 위성 세포의 분리에 대해 설명합니다. 근육은 다른 아가미 아치에서 시작. 이어서, 위성 세포 분화를 연구하기 mm 크기의 스폿 코팅에 배양했다. 이 접근 방법은 위성 세포의 팽창 및 계대를 피한다.
Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.
약 1 : 500 ~ 1 : 1,000 신생아는 입술 및 / 또는 구개 (CLP)를 포함하는 틈을 전시; 따라서, 이것은 한 사람의 가장 흔한 선천성 기형이다. 부드러운 입천장의 근육은 음성, 연하, 그리고 흡입하는 동안 부드러운 미각의 기능을 위해 중요하다. 부드러운 미각의 갈라진 틈이있는 경우, 이러한 근육이 비정상적으로 구개 뼈의 뒤쪽 끝 부분에 삽입됩니다.
연구 개는 코를 통해 공기가 빠져 나가는 것을 방지 연설에서 위아래로 이동합니다. 미각의 갈라진 어린이는 구개 범인 두 기능 부전 2,3로 알려진 현상의 결과로이 제어 기능이 없습니다. 치료 프로토콜이 변수이지만, 부드러운 구개의 수술 수리 유아 (생후 6-36개월) 4에서 일어난다. 부드러운 미각의 이상 삽입 근육 수술 5-7 보정 할 수 있지만, 구개 범인 두 기능 부전은 30 %로 7 %에서 지속환자 2,3,8-10의.
위성 세포 SCS ()의 작용을 통해 재생하는 골격근의 기능은 잘 확립되어있다 (11, 12). 근육 손상시, SCS는 활성화 및 부상의 사이트로 이동한다. 그런 다음, 증식 분화, 새로운 근섬유 또는 수리 손상된 사람 (13)을 형성하기 위해 융합. 그들의 자손, 증식 근육 모세포가 추가로 근육 조직 결정 요인 1 (MyoD) (16)을 표현하면서 대기 SCS는, 전사 인자 Pax7 14, 15를 표현한다. 차별화 근육 아세포 17 (MyoG)를 오게 닌 표현하기 시작합니다. 근육 아세포 분화의 단자는 근섬유의 형성 및 미오신 중쇄 (MyHC) (16, 18)와 같은 근육 특이 단백질의 발현에 의해 표시된다.
최근 몇 가지 전략은 사지의 근육 19-23의 근육 재생을 향상시키기 위해 재생 의학에 사용되어왔다. 에 대한 구체적인 연구그것은 최근에 그들이 여러 측면 (24)의 다른 근육과 다를 것을 증명했기 때문에 branchiomeric 머리 근육도 중요하다. 사지 근육과는 대조적으로, 그것은 branchiomeric 머리 근육이 덜으로 SC (25)를 포함하는 느린 재생,보다 섬유 결합 조직이 다른 전사 인자를 발현 branchiomeric 머리 근육에서 SC와 증식, 또한 부상 (26) 이후에 형성하는 것이 제안되었다. 예를 들어, Tcf21, 안면 근육 형성 용 전사 인자 강하게 머리 근육 재생에 있지만 거의 사지의 근육 (25)를 재생 표시된다. CLP 환자의 부드러운 입천장의 근육은 일반적으로 작고 덜 정상 구개 근육 27,28에 비해 잘 구성되어 있습니다. 느리고 빠른 섬유는 모두 부드러운 구개 근육에 존재하지만 느린 섬유는 더 풍부하다. 대조적으로, 분열 근육도 빠르고 높은 섬유의 비율 및 감소 된 모세관 공급 포함일반 연구 개 근육 29-31 비교. 빠른 섬유는 수축에 의한 상해 31-33 더 많은 경향이있다. 첨부 가난한 모세관 공급도 섬유증 (34, 35)을 촉진 할 수있다. 이러한 모든 측면은 수술 갈라진 폐쇄 (36) 후 연구 개 근육의 가난한 재생에 기여할 수있다. 이러한 관점에서, 헤드 branchiomeric 근육으로 SC의 분리 및 특성화를위한 프로토콜은 중요하다. 이 branchiomeric 머리 근육의 SC 생물학을 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다. 또한, 조직 공학을 기반으로 새로운 치료법은 CLP 및 두개 안면 영역을 손상시키지 다른 조건에서 수술 후 근육의 재생을 촉진하기 위해 개발 될 수있다.
일반적으로, SCS는 근육 조직 (14)의 분해 후에 얻어 질 수있다. 닦지 효소 소화 및 분쇄은 일반적으로 자신의 틈새 시장에서 희주를 해제해야합니다. SCS는 FR, 무지 14,37,38 접시에 미리 도금에 의해 정제 할 수있다actionation는 퍼콜 (39, 40)에, 직관 형 형광등 또는 자기 또는 셀은 41-43 정렬. 여기에서 우리는 젊은 성인 쥐의 branchiomeric 머리 근육에서 위성 세포의 분리를 위해 새로운 경제 및 신속한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 이전 원고 (14) 및 특히 작은 조직 샘플에 대한 적응에 기초한다. 1 차, 2 차, 4 차 아가미 아치에서 발생하는 대표적인 근육에서 희주의 분리는 설명한다. 분리 후 위성 세포의 낮은 숫자는 분화를 연구 할 수 밀리미터 크기의 세포 외 기질 젤 관광 명소 배양. 이 방법은 확장으로 SC 및 계대에 대한 요구를 피한다.
다른 branchiomeric 머리 근육에서 희주 전에 확장 및 계대없이 한 9 주령의 Wistar 쥐와 세포 외 기질 젤 명소에 직접 배양에서 분리 하였다. 분리 후, 세포를 계수하고, 동일한 셀 밀도로 시딩. 세 가지 다른 근육의 병렬 분리의 경우,이 방법은 약 4 시간이 걸립니다. 배양 오염을 방지하기 위해, 중요한 단계는 근육 절개 후 70 % 알코올에 신속한 세정이다.
SC 분리 중에 작은 조각으로 근육 조직 (약 2mm)을 절단하지만,이 때문에 세포 손상의 소세포 수율 초래하므로 너무 닦지을 방지하는 것이 중요하다. 또한, 소화 효소의 지속 기간은 또한 손상되지 않도록주의하여 현미경으로 점검해야한다. 소화의 목적은 근섬유를 해리하는 것이다. 분리 된 세포의 90 % 이상이 Pax7을 표현하기 때문에, 더 이상의 정제 (도 6-8) 필요하지 않다.이 같은 퍼콜 (39, 40)에 코팅 요리 14,37,38에 사전 도금, 분류 등의 다른 방법의 추가 정제 단계를 피할 수, 직관 형 형광등 또는 자기 또는 셀은 41, 43 정렬. 분쇄하고 이것이 기계적으로 SC의 방출을 허용하는 조직편과 피펫 팁의 개구부 사이에 전단을 야기하는 것이 필수적이다. (직경 팁 내부 : 1mm) 10ml를 피펫으로 분쇄가 어려운 경우, (직경 팁 내부 : 2mm)을 5 ml 피펫 먼저 사용할 수 있습니다. 대안으로, 유리 파스퇴르 피펫 원하는 직경에서 절단 될 수 있고 사용될 수. 이 방법은 간단하고 효율적인 다른 근육 샘플들로부터 SC의 동시 분리를 허용한다.
용으로 SC 배양 플레이트는 젤라틴이나 콜라겐으로 코팅 될 수 있지만, 우리의 이전 연구는 세포 외 기질은 콜라겐 겔 (38)보다 전위 근육 조직의 유지를위한 훨씬 더 나은 것을 보여준다. 세포 외 기질의 겔 스팟밀리미터 크기 (10 μL / O 2mm 또는 20 μL / O 4mm)의 증식과 세포의 제한된 숫자와 희주의 분화에 대한 연구를 할 수 있습니다. 분화 분석을 위해 약 8-20 배 적은 세포를 24 웰 플레이트 (O 15.6 ㎜)에 비해 필요하며, 적은 약 80-200 배는 35mm 페트리 접시 (Ø 35mm) 14,38 비교.
세포 외 기질 겔 고가이기 때문에,이 방법은 또한보다 비용 효율적이다. 또한, 챔버 슬라이드를 플라스틱 커버에 의해 대체 될 수는 더 비용 절감을 미끄러. 세포 외 기질 겔의 제조를위한 챔버 슬라이드 밤새 건조 필수적인 스폿. 세포 외 기질 겔 스팟 투명 같이, 조명을 위로하여 바닥면에 점을 표시 할 필요가있다. 챔버 슬라이드 쉬운 조작의 페트리 접시에 고정되어 있습니다. 또한 세포 배양 확장에 작은의 희주를 연구 할 수있는 가능성을 제공하는 필요가 없습니다근육 또는 작은 근육 샘플을 LER. 다르게는, PCR 또는 근육에 대한 예는 셀이 더 필요한 경우 전술 한 바와 같이, 갓 고립으로 SC 먼저 T75 플라스크로 확장 될 수있다 구성한다.
SCS는이 프로토콜을 사용하는 분리 직후 유동 세포 계측법으로 추가의 정제에는 적합하지 않다 절연. 프로 나제와 소화 표면의 광범위한 소화 14 항원이 발생합니다. 다른 로트 번호가 차등 아세포의 증식과 분화에 영향으로 세포 배양에 사용되는 말의 혈청 및 소 태아 혈청 먼저 제대로 분리하기 전에 특징으로해야합니다.
최근, 아가미 아치와 헤드 중배엽 (예 외안근) (24)로부터 유도 된 근육에 관심이 증가하고있다. 그것은 분명 머리와 다리 근육이 매우 다른 특성을 가지고 있음을 입증하고있다. 오래된 동물의 턱 근육이 다시 보인다사지 근육 (25), (26)과 비교하여 자신의 재생 능력을 주석 박. 외안근에서 SCS는 머리 근육에서 희주에 필적하는 강력한 증식과 분화 능력을 보유하고, 사지 근육으로 SC (24)보다 더 큰 생착 가능성을 보여줍니다.
섬유 형 분포 및 미오신 조성물은 근육 그룹 중에서 또한 종간 변한다. 인간의 첫 번째 아가미 아치에서 발생하는 근육은 심장 근육을 개발하기위한 전형적인 느리고 빠른 두 섬유 (서브 타입 인천 국제 공항과 IIX), 신생아 myosins 및 myosins가 포함되어 있습니다. 설치류에서 이러한 근육은 약 95 % 빠른 섬유 마이 오신 IIA 및 IIB) 44 ~ 46이 포함되어 있습니다. 조류 근육에 대한 연구는 서로 다른 근육 섬유 유형에서 희주는 분화 능력에 차이가 있음을 보여줍니다. 느린 섬유에서 희주의 두 섬유의 종류 47로 분화 할 수있는 동안 빠른 섬유에서 SCS는 만, 빠른 근육 섬유로 분화. 또한, 빠른 근육 희주의 비율섬유는 느린 근육 섬유 48, 49에 비해 낮다. 이것은 섬유 형 분포 안면 영역에서 근육에 대한 연구에서 고려되어야한다는 것을 나타낸다. 구개열 근육과 마찬가지로, 설치류의 LVP 빠른 섬유 (50)에게 거의 독점적으로 포함되어 있습니다. 그 때문에, LVP로부터 SCS는 구개열 분야의 전임상 연구를 위해 적합하다.
이 프로토콜은 branchiomeric 머리 근육 또는 다른 작은 근육 또는 작은 근육 샘플에서 파생 된 희주을 연구하는 새로운 가능성을 제공합니다. 이는 구개열로서뿐만 아니라 작은 근육에 영향을 미치는 다른 조건에 조건 악안면 영역에서 근육의 재생을 개선하기위한 새로운 치료법의 개발을 용이하게 할 것이다.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).
Hypodermic Needle 25G 0,5x25m | BD Microlance | 300400 | |
Dissecting scissors | Braun | BC154R | |
Micro forceps straight | Braun | BD330R | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton | 0205 | |
Alcohol 70% | Denteck | 2,010,005 | |
Permanox Slide, 8 Chamber | Thermo Scientific | 177445 | |
6 well cell culture plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) | Greiner bio-one | 664160 | |
15 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352097 | |
50 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |
Cell strainer (40 μm) | Gibco | 431750 | |
10 mL serological pipette | Greiner bio-one | 607180 | |
20µL FT20 | Greiner bio-one | 774288 | |
Matrigel, Phenol-Red Free | BD Biosciences | 356237 | 10 mL |
Pronase | Calbiochem | 53702 | 10KU |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569-010 | 500 mL |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 3600511 | 500 mL |
Horse Serum | Gibco | 26050088 | 500 mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
Chicken Embryo Extract | MP Biomedicals | 2850145 | 20 mL |