A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.
High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.
Bij gentherapie toepassingen is het van groot belang cytotoxische en immunogene bijwerkingen veroorzaakt door expressie van virale proteïnen, het transgen zelf of binnenkomende virale eiwitten voorkomen. Adenovirusvectoren (AdV) worden veelvuldig gebruikt om vreemd DNA te introduceren in een grote verscheidenheid van cellen om het effect van transgenexpressie 1,2 onderzoeken. De meest geavanceerde versie van AdV wordt vertegenwoordigd door hoge capaciteit adenovirus vectoren (HCAdV) ontbreken alle virale coderende sequenties 3,4 en biedt daarmee een verpakking capaciteit tot 35 kb in combinatie met een lage immunogeniciteit en lage toxiciteit 5-8. Vanwege hun hoge verpakkingscapaciteit ze laten leveren van grote of meerdere transgenen met een enkele dosis vector. Daarom, zij vertegenwoordigen een waardevol instrument voor de onderzoeksgemeenschap.
In tegenstelling tot de eerste of tweede generatie AdV zonder de vroege genen E1 en / of E3 die eenvoudig kunnen worden geproduceerd met behulp van commerciële kits, vector genoom bouw en virus productie van HCAdV is complexer. Het systeem voor de constructie van HCAdV genomen is gebaseerd op het plasmide pAdFTC met een HCAdV genoom zonder alle virale coderende sequenties en shuttle plasmide pHM5 9-12. Elk gen van belang tot 14 kilobasen (kb) worden gekloneerd in de shuttle vector pHM5 waarbij de meervoudige kloneringsplaats geflankeerd door herkenning / splitsen plaatsen van de homing endonucleasen PI- Sce I I- Ceu I. Daarom kan een gekloneerd gen van interesse worden vrijgegeven door opeenvolgende PI- Sce I en I Ceu I digesteert voor daaropvolgende gerichte insertie in dezelfde restrictieplaatsen aanwezig in het genoom HCAdV in het plasmide pAdFTC. In pAdFTC de transgene insertieplaats tussen de PI- Sce I en I Ceu I splitsingsplaatsen wordt geflankeerd door DNA stuffer en de coderende adenovirale sequenties die vereist zijn voor genoom verpakken als de 5 'en 3' omgekeerde eindstandige herhalingen (ITR's)aan beide uiteinden en het verpakkingssignaal stroomafwaarts van het 5'ITR. De extra DNA stuffer een optimale grootte van de uiteindelijke HCAdV genoom variëren van 27 tot 36 kb efficiënte verpakking tijdens virusproductie te waarborgen. Aangezien pAdFTC is een groot plasmide met tot 45 kb (afhankelijk van de grootte van het ingebrachte transgen) en het gebruik van homing endonucleases naar verhouding lange verwijzingen DNA herkenning vertoont sterke DNA bindende verscheidene opschonen stappen nodig tijdens de overdracht van het transgen uit pHM5 naar pAdFTC. Zorgvuldige behandeling vermijden van schuifkrachten wordt aanbevolen.
De ITR's van de HCAdV genoom geflankeerd door NotI restrictie-enzym herkenningsplaatsen direct stroomopwaarts van het 5'ITR en stroomafwaarts van de 3'ITR 12. Daarom kan HCAdV worden vrijgegeven door Notl digest voor daaropvolgende transfectie van het virale genoom in de HCAdV producerende cellijn. Merk op dat het gebruik van het restrictie-enzym Notl voor relgemak van het virale genoom van het plasmide pAdFTC impliceert dat de ingebrachte transgen mist NotI DNA herkenningsplaatsen. De HEK293 cellen gebaseerde producerende cellen (116 cellen) stabiel uitdrukken Cre recombinase. Voor virus amplificatie 116 cellen zijn co-geïnfecteerd met een helper virus (HV) het verstrekken van alle AdV genen die nodig zijn voor replicatie pt verpakken in trans 3,4. De HV is een eerste generatie AdV met een floxed verpakking signaal dat tijdens virusreplicatie door Cre recombinase tot expressie gebracht in 116-cellen 4 wordt verwijderd. Dit zorgt ervoor dat voornamelijk HCAdV genomen met een intacte inpaksignaal worden ingekapseld.
Pre-amplificatie van het HCAdV wordt uitgevoerd door het uitvoeren van seriële passage in stappen 116 cellen gekweekt op oppervlakken in weefselkweekplaten. Na elke doorgang virusdeeltjes vrijkomen uit geïnfecteerde cellen door het uitvoeren van drie achtereenvolgende vries- dooi stappen. Bij elke passage steeds meer cellen worden besmet met1/3 cellysaat van de voorgaande passage. Tenslotte lysaat uit de laatste pre-amplificatiestap wordt gebruikt om producerende cellen gekweekt in suspensie in een spinner fles voor grootschalige amplificatie infecteren. Virionen gezuiverd uit de celsuspensie door het uitvoeren van ultracentrifugatie in een cesium chloride dichtheidsgradiënt 4,12. Met deze procedure lege deeltjes volledig geassembleerd deeltjes worden gescheiden in twee afzonderlijke banden. Om verder te concentreren de HCAdV deeltjes een tweede niet-geleidelijke ultracentrifugatie stap wordt uitgevoerd. Vervolgens werd de verkregen band met de HCAdV verzameld en gedialyseerd tegen een fysiologische buffer. Vector laatste voorbereidingen worden gekenmerkt met betrekking tot de aantallen absolute virusdeeltjes, besmettelijke deeltjes en HV besmetting niveaus. Absolute virale deeltjes kan worden bepaald door het lyseren van virusdeeltjes en meten van de absorptie bij 260 nm of door het uitvoeren van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) 12. Besmettelijkheid van de purified virusdeeltjes kan worden bepaald door qPCR meten HCAdV genomen aanwezig in geïnfecteerde cellen 3 uur na infectie.
De hier gepresenteerde protocol maakt zuivering van HCAdV vectoren gebaseerd op menselijke adenovirus type 5 gebaseerd op eerder beschreven procedures 4,12. De HCAdV genoom binnen pAdFTC plasmide mist alle adenovirus genen en alleen draagt de 5'- en 3'-ITR's en het verpakkingssignaal. In deze strategie de HV AdNG163R-2 4 biedt alle benodigde genen voor een efficiënte virus productie in trans. Dit biedt een verpakking van maximaal 35 kb, die duidelijk outcompetes eerste e…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by DFG grant EH 192/5-1 (A.E.), the EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), the UWH Forschungsförderung (E.S. and W.Z), and the PhD programme of the University Witten/Herdecke (P.B.). J.L. was supported by a stipend of the Chinese Scholarship council and T.B. and M.G by the Else Kröner-Fresenius foundation (EKFS).
I-CeuI | New England Biolabs | R0699S | restriction digest |
PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | restriction digest |
T4 Ligase | New Engand Biolabs | M0202S | ligation |
SwaI | New England Biolabs | R0604S | restriction digest |
NotI | New England Biolabs | R0189S | restriction digest |
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | dephosphorylation of digested plasmids |
Hygromycin B | PAN Biotech | P02-015 | selection of CRE expressing 116 cells |
DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | Hek293T cell culture medium |
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle | PAN Biotech | P04-08500 | 116 cell culture medium |
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) | PAN Biotech | P04-36500 | washing of cells, resuspension of cells |
250 ml storage bottle | Sigma | CLS430281-24EA | infection of 116 cells grown in suspension |
500mL PP CentrifugeTubes | Sigma | CLS431123-36EA | sedimentation of cells from suspension culture |
Spinner flask | Bellco | 1965-61030 | growth of 116 cells in suspension |
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes | Beckmann Coulter | 344059 | density gradient centrifugation |
Ultracentrifuge | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
SW-41 rotor | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane | VWR | 132129 | dialysis tubing |
ready-to-use dialysis cassettes | Thermo | 66383 | dialysis |
one shot DH10B electrocompetent E. coli | invitrogen | C4040-52 | transformation of ligation reactions |
PureYield™ Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | midiprep |
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit | Peqlab | 12-3396-02 | isolation of genomic DNA |
SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | tranfection of 116 cells |
opti MEM (10 % FBS) | Gibco | 31985-062 | transfection of 116 cells |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 170-8882 | q-PCR |
CFX 96 C1000 touch | Biorad | qPCR machine | |
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carl Roth | A156.1 | purification of DNA |
Cesium chloride | Carl Roth | 8627.1 | density gradient centrifugation |
sodium acetate 99% | Carl Roth | 6773.2 | DNA precipitation |
LB medium | Carl Roth | X968.3 | bakterial growth medium |
ethanol 99,8% pure | Carl Roth | 9065.5 | DNA precipitation and washing |
SDS 99,5% | Carl Roth | 2326.2 | lysis buffer |
EDTA | Carl Roth | 8043.2 | lysis buffer |
Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | dialysis buffer/ lysis buffer |
glycerol 99,5% | Carl Roth | 3783.1 | dialysis buffer |
MgCl2 98,5% | Carl Roth | KK36.2 | dialysis buffer |
NaCl | Carl Roth | 3957.1 | optional dialysis buffer |
KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | optional dialysis buffer |
sucrose | Carl Roth | 9286.1 | optional dialysis buffer |
Na2HPO4x2H2O | Carl Roth | 4984.2 | optional dialysis buffer |
1,5ml tubes | sarstedt | 72,730,005 | storage of virus preparations at -80°C |