אינדוקציה והערכה של איסכמיה reperfusion פגיעה בלבבות עכברוש Langendorff-perfused
Summary
The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.
Abstract
The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.
Introduction
הבהרה של האירועים שבבסיס תגובת הלב לשתי איסכמיה ו reperfusion חיונית בשיפור הטיפול בהליכי אוטם שריר לב 1 ולב כירורגית שדורשים 2 צלב-הידוק אב העורקים. בעוד מודלים in vivo של פגיעת reperfusion איסכמיה לאפשר ניתוח נקודת סיום מאוד שימושי, הם לא יעילים כמו לחקר ההשפעות התפקודיות של פגיעת reperfusion איסכמיה בחריפות בזמן אמת. בנוסף, במודלי reperfusion איסכמיה vivo בדרך כלל לייצר שונות משמעותיות בגודל אוטם, ומשלוח ישיר של תרופה ללב בזמן reperfusion הוא מאתגר. הניצול של מערכת לב Langendorff מבודדת ללימוד פגיעת reperfusion איסכמיה מאפשר להערכה תפקודית בזמן אמת של טיפולים תרופתיים, אזור האחיד של רקמת אוטם שריר, ומשלוח מיידי של תרופה ישירות לשריר הלב.
תאר ב ראשוןy אוסקר Langendorff בשינה 1895 3, הלב Langendorff מבודד הוא מודל חזק ללימוד פגיעת reperfusion איסכמיה, ששמש במחקר reperfusion איסכמיה במשך 40 השנים האחרונות 4,5. הנה, כמה שינויים נעשו כדי לייעל את הלב המבודד לניתוח פונקציונלי. בcannulation באתרו של אב העורקים בזמן הלב פועם מבטיח כי הלב אינו חווה נפשית מראש איסכמי, שהיה משנה את תוצאות ניסויי reperfusion איסכמיה 6. כדי להקל על זה, tracheotomy מתבצע, המאפשר אוורור והבטחת יציבות פיזיולוגית של העכברוש במהלך ניתוח. הלב אז מצורף לעמודת מים במקטורן זכוכית ספירלה שדרכו חיץ קרבס Henseleit מועבר באמצעות זלוף מדרדר ישירות לאב העורקים. בלון מלוח מלא מוכנס לתוך החדר השמאלי ומחובר למתמר לחץ, המאפשר למדידה בזמן אמת של לחצים מהחדרחישוב ד פרמטרים פונקציונליים מרובים. בסיומו של הניסוי, הלב סמוק עם מי מלח קר כדי לעצור את ההתכווצות ופלאש קפוא בחנקן נוזלי כדי לאפשר ניתוח במורד הזרם של רמות ה- DNA, RNA והחלבון. שונה כך, לב Langendorff perfused משמש כמערכת יעילה לניטור ישיר של ההשפעה הפיזיולוגית של התערבויות תרופתיות בכל עת בחריפות במהלך פציעת reperfusion איסכמיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מבודד לב החולדה perfused יכול לשמש בהצלחה כדי לחקור את ההשפעה של התערבות תרופתית בלב נפשית מראש לפגיעה reperfusion איסכמיה 9. עם זאת, יש כמה צעדים חיוניים להליך שחייב להיות אחיד כדי להבטיח תוצאות לשחזור. שמירה על טמפרטורה של 37.4 מעלות צלזיוס במערכת היא קריטית, כמו גם היפות?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרסום זה נתמך על ידי המחקר קליני וTranslational (SCTR) מכון הדרום קרוליינה, עם בית אקדמי באוניברסיטה לרפואה של דרום קרוליינה, NIH / NCATS גרנט מספר UL1 TR000062. תמיכה נוספת סופקה על ידי פרס הצטיינות VA BX002327-01 לDRM. DJH נתמכה על ידי NIH / NCATS גרנט מספר TL1 TR000061 ועל ידי NIH גרנט מספר T32 GM008716. הים היה נתמך על ידי NIH גרנט מספר T32 HL07260.
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | 203726 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | RES20765-A7 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich | C8106 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Octanoic Acid | Sigma Aldrich | C2875 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Medical Pressure Transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| Masterflex Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07521-40 | |
| Masterflex Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-07518-10 | |
| Heated circulating water bath | Lauda | M3 | |
| Tubing Flow Module | Transonic | TS410 | |
| Modular Research Console | Transonic | T402 | |
| Inline flow sensor | Transonic | ME2PXN | |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | PL3508 | |
| LabChart data acquisition software | AD Instruments | MLU60/8 |
Referências
- Bainey, K. R., Armstrong, P. W. Clinical perspectives on reperfusion injury in acute myocardial infarction. American Heart Journal. 167 (5), 637-645 (2014).
- Beyersdorf, F. The use of controlled reperfusion strategies in cardiac surgery to minimize ischaemia/reperfusion damage. Cardiovascular Research. 83 (2), 262-268 (2009).
- Langendorff, O. Untersuchugen am überlebenden Säugethierherzen. Pflügers Archives. 61, 291-307 (1895).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Tyers, G. F., Todd, G. J., Neely, J. R., Waldhausen, J. A. The mechanism of myocardial protection from ischemic arrest by intracoronary tetrodotoxin administration. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 69 (2), 190-195 (1975).
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. The Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. American Heart Journal. 101 (5), 593-600 (1981).
- Aune, S. E., Herr, D. J., Mani, S. K., Menick, D. R. Selective inhibition of class I but not class IIb histone deacetylases exerts cardiac protection from ischemia reperfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 138-145 (2014).
- Yellon, D. M., et al. The protective role of heat stress in the ischaemic and reperfused rabbit myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 24 (8), 895-907 (1992).
- Khaliulin, I., et al. Temperature preconditioning of isolated rat hearts–a potent cardioprotective mechanism involving a reduction in oxidative stress and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore. The Journal of Physiology. 581 (Pt 3), 1147-1161 (2007).
- Molojavyi, A., et al. Effects of ketamine and its isomers on ischemic preconditioning in the isolated rat heart). Anesthesiology. 94 (4), 623-629 (2001).
- Asfour, H., et al. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. The Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Sill, B., Hammer, P. E., Cowan, D. B. Optical mapping of langendorff-perfused rat hearts. The Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Ferrera, R., Benhabbouche, S., Bopassa, J. C., Li, B., Ovize, M. One hour reperfusion is enough to assess function and infarct size with TTC staining in langendorff rat model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 23 (4), 327-331 (2009).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart: Characteristics and cautions. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (11), 867-878 (2003).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack BA, ., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the langendorff-perfused mouse heart model. Experimental Physiology. 94 (1), 54-70 (2009).
- Xie, M., et al. Histone deacetylase inhibition blunts ischemia/reperfusion injury by inducing cardiomyocyte autophagy. Circulation. 129 (10), 1139-1151 (2014).
