Иммуногистохимический Визуализация гиппокампа активности нейронов После пространственного обучения в мышиной модели нарушениями развития нервной
Summary
Мы опишем протокол иммуногистохимии для изучения профиля активации гиппокампа нейронов после воздействия пространственной учебной задачи в модели мыши характеризуется когнитивных дефицитов развития нервной системы координат. Этот протокол может быть применен к обеих генетических или фармакологических моделей мышей, характеризующихся когнитивных нарушений.
Abstract
Индукционная фосфорилированного внеклеточной регулируемой киназы-(Перк) является надежным молекулярным считывания обучения зависит от нейронов активации. Здесь мы опишем протокол Перк иммуногистохимии для изучения профиля активации гиппокампа нейронов после воздействия пространственной учебной задачи в модели мыши характеризуется когнитивных дефицитов развития нервной системы координат. В частности, мы использовали Перк иммуноокрашивания изучать нейронов активации следующее Моррис водном лабиринте (MWM, классическая гиппокампа-зависимой задача обучения) в Engrailed-2 нокаутом (EN2 – / -) мышей, модель расстройств аутистического спектра (ASD). По сравнению с дикого типа (WT) управления, en2 – / – мышей показали значительные дефициты пространственное обучение в MWM. После MWM, значительных различий в количестве одной особенностью-позитивных нейронов были обнаружены в конкретных гиппокампа подполей EN2 – / – мышей, по сравнению с WT животных. Таким образом, наш протокол может решительно обнаружить различия вПерк-позитивных нейронов гиппокампа, связанные с зависит от обучения обесценения в мышиной модели ASD. В целом, наш протокол может быть применен для исследования профиля активации нейронов гиппокампа в обоих генетических или фармакологических моделей мышей, характеризующихся когнитивных нарушений.
Introduction
Неврологические расстройства включают широкий и гетерогенную группу расстройств, таких как синдром Дауна, синдром ломкой Х (FXS), синдром Ретта, нейрофиброматоз, клубневые склероз и ASD, в которых развитие и созревание центральной нервной системы (ЦНС) нарушается во время раннего внутриутробный период 1. Эти развития дисфункций мозга может вызвать глубокие, всю жизнь воздействуют на моторные функции, языка, обучения и процесса памяти. Множество генетических и экологических факторов были вовлечены в патогенез расстройств нервной системы в течение последних нескольких лет 2,3. Даже если молекулярные механизмы, лежащие в основе клинического фенотипа неизвестны, упомянутые выше результаты позволили развитие нескольких мышиных моделях этих нарушений. Обучения и памяти дефицита были определены в ряде этих мышиных моделей, таких как TSC1 +/- +/-, TSC2,НФ1 +/- и en2 – / – мышей 2,4-7. Важной задачей в области развития нервной расстройств идентификации клеточных и молекулярных процессов, лежащих в основе памяти и обучения дисфункции. Отдельные сигнальные пути активированные при обучении или памяти можно индуцировать транскрипцию специфических генов и в конечном счете приведет к нового синтеза белка. Непосредственные-ранних генов (IEGs) активации и белка зависит от синаптических изменений быстро индуцируется в нейронах головного мозга в ответ на активность нейронов и поведенческих обучения 8,9.
Дефицит пути с участием Нейрофибромин сигнализации были связаны с нарушениями нервной системы обучения в расстройств. Нейрофибромин является продуктом гена NF1, чьи мутации вызывает нейрофиброматоз типа 1, комплекс генетический синдром, характеризующийся опухолей нервной системы, поведенческих и моторных задержек и познавательной DISAностей 10. Мыши, гетерозиготные по Nf1 удаления ограничения, чтобы тормозных нейронов показать дефицит в ранней фазе долгосрочного потенцирования (LTP), а также угрозу пространственного обучения в MWM 5,11,12. Интересно, что дефицит НФ1 в этой модели мыши приводит к более-активации сигнализации Рас в тормозных интернейронов в процессе обучения, что приводит к увеличению ЭРК фосфорилирования и, наконец, в ненормальном повышения высвобождение ГАМК из этих нейронов 5.
Основываясь на этих выводах, визуализация нейронной активности после поведенческих задач представляет собой способ реконструкции конкретных схем, участвующих в нервной заболеваний. Протокол иммуногистохимии, описанный здесь направлен на оценку и количественно гиппокампа уровни ЭРК фосфорилирования следующие MWM в модели ASD мыши с когнитивными нарушениями. МВМ широко используется для изучения гиппокампа в зависимости пространственное обучение и память у грызунов 13,14 </sдо>. Мы решили использовать ERK фосфорилирования как молекулярная считывания задач зависит от гиппокампа обучения, так как ЭРК было показано, играют важную роль в процессах обучения и памяти формирования 15. Кроме того, ЭРК путь необходим для опыта зависит от пластичности в развивающихся зрительной коры 16. Наконец, мыши, лишенные одного из двух изоформ (ERK) ERK2 в шоу ЦНС отмечены аномалии в познавательных, эмоциональных и социальное поведение 17, указывая, что ERK сигнализации может играть решающую роль в патогенезе нервной расстройств, таких как ASD.
Мы использовали Engrailed 2 нокаутом (EN2 – / -) мышей в качестве модели развития нервной расстройств. En2 – / – мыши обнаруживают анатомические и поведенческие "АСД-как" функции, в том числе потери переднего мозга интернейронов 18, снижение экспрессии АСД-родственных генов 19, снижение общительности, и нарушение когнитивной гибкости 6,7,20. Пространственное learniнг и дефекты памяти, такие как те, обнаружены в MWM, особенно надежный в en2 – / – мышей 6,7 и может иметь отношение к когнитивных нарушений, наблюдаемых у пациентов 21 ASD. Кроме того, мы показали, что нарушение пространственного обучения в MWM связана со снижением экспрессии Нейрофибромин и увеличение Перк уровней в воротах в en2 – / – мышей взрослых 7. Здесь мы представляем подробный протокол для иммуногистохимического характеристики Перк следующей MWM в этой модели ASD мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставляем Перк протокол иммуногистохимии для выявления нейронов активации следующей MWM в en2 – / – мышей, модель мыши нервной расстройств. Пониженные уровни одной особенностью были обнаружены в СА3 подполе EN2 – / – мутанты сравнению с WT. В отличие от того, что наблюда?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотим поблагодарить административный состав CIBIO (университет Тренто) и CNR Neuroscience института помощи. Джованни Провенцано поддерживается пост-докторской стипендии от Fondazione Veronesi (Милан, Италия). Эта работа финансировалась итальянским Министерством университетов и исследований (PRIN 2008 грант № 200894SYW2_002 и прин 2010-2011 грант # 2010N8PBAA_002 для YB), Университет Тренто (CIBIO запуска грантовой YB) и Телемарафон фонда (грант # GGP13034 к Ю.Б.).
Materials
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto – Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| Image J software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
Referências
- Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
- Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
- West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
- Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
- Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
- Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
- Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
- Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
- Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O’Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
- Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
- Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
- Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
- Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
- Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
- Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
- Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
- Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
- Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
- Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).
