Nörogelişimsel Bozukluklar Fare Modeli Mekansal Öğrenme ardından Hipokampal Nöron Faaliyet immünohistokimyasal Görselleştirme
Summary
Biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için bir immünohistokimya protokol açıklar. Bu protokol bilişsel karakterize hem genetik ya da farmakolojik fare modellerine uygulanabilir.
Abstract
Fosforile ekstraselüler regüle kinaz (pERK) uyarılması öğrenme bağımlı nöronal aktivasyon güvenilir bir moleküler okuma olduğunu. Burada, biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için pERK immünhistokimya protokol açıklar. Fareler, otizm spektrum bozuklukları modeli (ASD) Özellikle, Morris su labirenti Engrailed-2 nakavt (MWM, klasik hipokampus bağımlı öğrenme görev) – (- / En2) aşağıdaki nöronal aktivasyon incelemek için pERK immün kullanılır. Vahşi tip (WT) kontrol ile karşılaştırıldığında, En2 – / – fareler MWM önemli uzamsal öğrenme yetersizlik göstermiştir. WT hayvanlara kıyasla, farelerin – / – MWM sonra, pERK pozitif nöronların sayısında anlamlı bir fark, belirli hipokampal EN2 bölgesinin alt alanlarında tespit edilmiştir. Böylece, bizim protokol sağlam farklılıkları tespit edebilirASD bir fare modelinde hipokampus bağımlı öğrenme bozukluğu ile ilişkili pERK-pozitif nöronlar. Daha genel olarak, protokol bilişsel bozukluklar ile karakterize edici özelliği, her iki genetik ya da farmakolojik fare modellerinde hipokampal nöron aktivasyon profilini araştırmak için uygulanabilir.
Introduction
Nörogelişimsel bozukluklar gibi merkezi sinir sistemi (MSS) gelişmesi ve olgunlaşması sırasında erken rahatsız olduğu Down sendromu, frajil X sendromu (FXS), Rett sendromu, nörofibromatozis, yumrulu skleroz ve ASD gibi hastalıkların geniş ve heterojen bir grup içerir Prenatal dönem 1. Bu gelişimsel beyin işlev bozuklukları motor fonksiyon, dil, öğrenme ve bellek süreci üzerinde derin, yaşam boyu etkilere neden olabilir. Genetik ve çevresel faktörlerin bir bolluk son yıllarda 2,3 sırasında nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde suçlanmıştır. Klinik fenotip altında yatan moleküler mekanizmalar halen bilinmemektedir bile, yukarıda belirtilen bulgular, bu hastalıkların birkaç fare modellerinin geliştirilmesi sağladı. Öğrenme ve hafıza noksanlıkları gibi +/- tsc1 +/-, TSC2 olarak, bu fare modellerinde bir dizi tespit edilmiştir,NF1 +/- ve En2 – / – fareler 2,4-7. Nörogelişimsel bozuklukların alanında önemli bir zorluk hücresel ve moleküler süreçler bellek yatan ve disfonksiyonu öğrenme belirlenmesidir. Öğrenme ve bellek sırasında aktive Seçilen sinyal yolları spesifik genlerin transkripsiyonunu neden ve sonuç olarak de novo protein sentezinin yol açabilir. Hemen-Erken genler, (bacakları) aktivasyonu ve protein bağımlı sinaptik değişiklikler hızla nöronal aktivite ve davranışsal eğitim 8,9 yanıt olarak beyin nöronlarının indüklenir.
Nörofibromin içeren sinyal yolları içinde Açıkları nörogelişimsel bozukluklarda bozulmuş öğrenme ile ilişkili bulunmuştur. Nörofibromin olan mutasyon nörofibromatozis tip 1, karmaşık genetik sendrom sinir sistemi tümörleri, davranışsal ve motor gecikme ve bilişsel DISA ile karakterizedir neden olur NF1 geninin ürünüdürhastanın talimatları 10. Önleyici nöronlarla sınırlı NF1 silinmesi için heterozigoz olan fare, MWM 5,11,12 uzun süreli potansiyasyon erken faz (LTP), hem de tehlikeye uzamsal öğrenme eksiklikler göstermektedir. İlginç olarak, bu fare modelinde NF1 eksikliği artan ERK fosforilasyonu ve son olarak bu nöronların 5 GABA serbest anormal bir artışa yol açar, öğrenme sırasında inhibitör Ras sinyallemesinin bir aşırı aktivasyonuna yol açar.
Bu bulgulara dayanarak, davranış görevler sonrasında nöronal aktivitenin görselleştirme nörogelişimsel hastalıklarda rol oynayan spesifik devreleri yeniden bir yol gösterir. Burada açıklanan immünohistokimyası protokolü değerlendirmek ve bilişsel bozukluklar ile ASD fare modelinde MWm aşağıdaki hipokampal ERK fosforilasyon düzeylerini ölçmek hedefliyor. MWM yaygın kemirgenler 13,14 hipokampal bağımlı uzaysal öğrenme ve hafıza araştırmak için kullanılır </s> yedekleyin. Biz ERK öğrenme ve bellek oluşumu 15 önemli bir role sahip olduğu gösterilmiştir beri görev bağımlı hipokampal öğrenme moleküler okuma olarak ERK fosforilasyonu kullanmaya karar. Ayrıca, ERK yolu, geliştirme, görsel korteks 16 deneyime bağlı plastisite için gereklidir. Son olarak, MSS gösteride iki ERK izoformu (ERK2) birini eksik fareler ERK sinyal gibi ASD olarak nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde kritik bir rol oynayabileceğini belirten, bilişsel, duygusal ve sosyal davranışlar 17 anomalileri kutladı.
Nöro hastalıklar açısından bir model olarak farenin (- / – En2) Biz Engrailed 2 nakavt kullanılır. En2 – / – fareler ön beyin internöronlar 18 kaybı dahil anatomik ve davranışsal "ASD gibi" özellikleri, ASD-ilişkili genlerin 19 azaltılmış ifade göstermek, sosyallik azaldığı ve bozulmuş bilişsel esneklik 6,7,20. Mekansal Learning ve MWM tespit edilenler gibi hafıza kusurları, EN2 özellikle sağlam – / – fareler 6,7 ve ASD hastalarında 21 gözlenen bilişsel bozukluklar ile ilgili olabilir. – / – Yetişkin farelerde 7 Ayrıca, MWM bozulmuş normal süreçlerde indirgenmiş nörofibromin ekspresyonu ile bağlantılı ve EN2 arasında hilusunda pERK düzeylerinde artış olduğunu göstermiştir. İşte biz bu ASD fare modelinde MWm aşağıdaki pERK immunohistokimyasal karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
/ – – Fareler, nörogelişimsel bozuklukların fare modelini Burada, biz nöronal en2 içinde MWm aşağıdaki aktivasyon ifşa ettiği için bir pERK immünhistokimya protokol sağlar. / – – PERK düzeylerinin azalması en2 CA3 subfield tespit edilmiştir mutantlar WT ile karşılaştırıldığında. Farklı CA3 alt alanına, pERK pozitif nöronlarının genel bir artış gözlenen ne yerine iki hilus saptanmış ve EN2 bölgesinin GCL – / – fareler WT ile karşılaştırıldığında….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yardım için CIBIO (Trento Üniversitesi) ve CNR Nörobilim Enstitüsü idari personeline teşekkür etmek istiyorum. Giovanni Veronesi Provenzano Fondazione (Milan, İtalya) doktora sonrası bursu ile desteklenmektedir. Bu eser İtalyan Üniversitesi Bakanlığı ve Araştırma (PRIN 2008 hibe # YB ile 200894SYW2_002 ve PRIN 2010-2011 hibe # 2010N8PBAA_002), Trento Üniversitesi (YB için CIBIO start-up hibe) ve Telefon Kurumu (hibe # GGP13034 tarafından finanse edildi YB).
Materials
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto – Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| Image J software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
Referências
- Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
- Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
- West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
- Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
- Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
- Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
- Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
- Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
- Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O’Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
- Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
- Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
- Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
- Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
- Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
- Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
- Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
- Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
- Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
- Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).
