Framställning av Mica och kiselsubstrat för DNA Origami analys och Experiment

Summary

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Abstract

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Introduction

Först infördes 2006, utnyttjar DNA origami självorganiserande karaktär DNA-oligonukleotider att producera designable och mycket beställt nanostrukturer. ¹ En myriad av strukturer har rapporterats, från smiley ansikten till låst 3-dimensionella lådor. ² DNA origami kan funktionaliseras med olika biomolekyler och nanostrukturer, vilket ger upphov till forskningsansökningar inom nanoelektronik, medicin och kvantdatorer. ³ Men analysen och många framtida tillämpningar är inte bara beroende av konstruktion, men också på vidhäftningen av DNA origami nanostrukturer till ytor. De metoder som beskrivs i detta manuskript avser framställning av DNA-origami prover på två typer av underlag: glimmer och funktionaliserad kiseloxid.

Glimmer är substratet valt för DNA-origami studier eftersom det är atomiskt platt, med en skikthöjd av 0,37 nm ± 0,02 nm. ⁴ Det är också easily rengöras, vilket gör provberedning och atomkraftsmikroskopi (AFM) studier okomplicerad. Muskovit glimmer innehåller en hög täthet av kalium i varje klyvningsplanet, men dessa joner diffundera bort från glimmer ytan när den är i vatten. Mediera bindning av DNA-origami till glimmer substrat, Mg2 ⁺ används för att vända den negativa laddningen av glimmer och elektrostatiskt binda DNA-fosfatryggraden till substratet (Figur 1A). ⁵ Blandningar av glödgad DNA i närvaro av stora överskott av stapel strängarna ge hög täckning och bra bilder på glimmer eftersom vidhäftningen av DNA origami till Mg2 ⁺ -terminated yta är mycket starkare än vidhäftningen av enkelsträngade oligonukleotider (stapel strängarna). Andra positivt laddade joner, inklusive Ni2 ⁺ och Co2 ⁺ kan användas för att styra vidhäftningen av DNA på glimmer. ^6,7 Ändring av koncentrationen av monovalenta och divalenta katjoner i lösning kan mediera adhEsionen och ytdiffusion andelen DNA-origami. ⁸ Men protokollet för framställning glimmersubstrat och sätta in och skölja origami ofta inte uttryckligen beskrivs i den publicerade manuskript. ⁹ Utan en tydlig protokoll, kan reproducerbara resultat vara svårt att få.

Glimmer är en isolator, så det är inte lämpligt som ett substrat för vissa tillämpningar inom nanoelektronik. Silicon passiv med en tunn nativ oxid har önskvärda elektroniska egenskaper, inklusive kompatibilitet med tidigare gratis Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) behandling för att skapa input / output strukturer och topografiska egenskaper. Kiselskivor som är lagrade i luft är passiverad med antingen en tjock termisk oxid eller tunna olegerade oxidfilm som är relativt smutsig, med en hög räkna partikelformigt. Kiseloxid har en mycket lägre ytladdningsdensitet än glimmer, och laddningstätheten är mycket beroende av oxid förberedelse och historia. Vid magnesium jonkoncentrationer above 150 mM, goda omfattningar (upp till 4 / im ²⁾ rektangulär DNA origami kan uppnås på syreplasmabehandlade kiselsubstrat; emellertid kan denna koncentration och täckning ändras beroende på storleken och utformningen av nanostrukturer som används. ¹⁰ Ett alternativt protokoll för avstämning av ytladdningen är att fästa en katjonisk självmonterat monoskikt av 3-aminopropyltrietoxisilan (APTES) (Figur 1B) till oxiden. Den primära aminen på APTES kan protoneras vid pH-värden under 9, modifiering av laddningen och hydrofobiciteten för substratet. ¹¹ För en fullständig monoskikt av APTES att framgångsrikt deponeras måste kisel lämpligt rengöras med Radio Corporation of America (RCA) protokoll . Dessa protokoll omfattar behandlingar i ammoniumhydroxid och väteperoxidlösningar (RCA1) för att avlägsna organiska rester och partikelföroreningar. En kort etsning i vattenhaltig fluorvätesyralösning avlägsnar skiktet av nativ oxid tillsammans mednågra jonföroreningar som ansluter sig till oxid. Slutligen prover utsatta för en klorvätesyra och väteperoxidlösning (RCA2) för avlägsnande av metall och joniska kontaminanter och bilda ett tunt, likformigt oxidskikt. ¹² De flesta renrum har utsett huvar för CMOS rengöringsprotokoll, med strikta regler om vad som kan användas inom dessa områden. Ett vanligt problem kommer i form av joner såsom natrium, vilket kan störa de elektroniska egenskaperna hos CMOS strukturer genom att skapa midbandgap fällor. ¹³ Joner som vanligen används i DNA-origami förberedelse och deponerings buffertar kan förorena CMOS bad och orsaka problem för andra forskare som använder renrummet. Av denna anledning använder vår grupp en "smutsiga" CMOS rengöringsbänk anordnad speciellt för de små prover som användes för DNA-origami forskning. Denna process är ett bra alternativ till den traditionella renrums set-up och kan vara lämpliga för laboratorier som inte har tillgång till en renrums CMOS bänk.

Protocol

1. Experiment planering och materialberedning Bestämma utformningen, koncentration och funktionalitet av DNA origami som kommer att användas i experimenten. 14-16 Här använder vi en DNA origami rektangel konstruktion framställd i 1x TAE / Mg2 + lösning (40 mM tris-bas, 20 mM ättiksyra, 2 mM EDTA och 12 mM magnesiumacetat, pH 8,0). 17 Autoklav alla tips, rör och behållare som ska användas. Dessa material måste alla vara autoklav kompatibla. Förbe…

Representative Results

Två variabler diktera täckningen av DNA-origami på substratet: lösningens koncentration och exponeringstid. De adsorptionsegenskaper av DNA origami på glimmer och APTES funktionaliserad kiseloxid har tidigare rapporterats. 13 Förhållandet mellan koncentrationen av DNA-origami i avsättningslösningen och de slutliga omfattningar på glimmer är sammanfattade i tabell 1 och figur 2, som visar ökande resultat koncentrations ökad täckning. Den tidsberoende bindning ses…

Discussion

Det finns flera steg som måste betonas att uppnå konsekventa och perfekt resultat. För glimmer prover, efter en strikt och noggrann sköljning och torkning regim, som i steg 3.3 och 3.4, kommer att se till att bilder av enskilda DNA-origami högkvalitativa kan uppnås med hjälp av AFM utan de olika problem som beskrivs i avsnittet Resultat representanten. Av största vikt för kiselprover är städning av underlaget. Efter rengöringsrutiner som beskrivs i steg 5,2 noggrant och minutiöst kommer att säkerställa at…

Materials

Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μL	VWR International, LLC	22491733	10 reload tray of 96 tips
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR International, LLC	87003-290	0.65 mL, natural
Research Plus Pippete – Single Channel – 20-200 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960F-3120000054 EACH	Adjustable Volume
Research Plus Pippete – Single Channel – 2-20 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960D-3120000038 EACH	Adjustable Volume
Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape	Office Depot, Inc.	602710	3/4" x 300", Pack of 2
Vortex Mixer	Thermo Scientific	M37610-33Q
Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm	Electron Microscopy Sciences	64917-2	6 per pack
6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat	Nova Electronic Materials, Ltd.	GC49266
Powder-Free Nitrile Examination Gloves	VWR International, LLC	82062-428	Catalog number is for size large
High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating	K-Tek Nanotechnology, Inc.	HA_NC/15
Autoclave Pan	A. Daigger & Company, Inc.	NAL692-5000 EF25341C
Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch – 1 dz	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	106-15055	Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves.
Tweezers PTFE 200 mm Square	Dynalon Corp.	316504-0002
Muscovite Mica Sheets V-5 Quality	Electron Microscopy Sciences	71850-01	10 per pack
Mica Disc, 10 mm	Ted Pella, Inc	50	Mica discs are optional
Scriber Diamon Pen for Glassware	VWR International, LLC	52865-005
Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap – 20 mL	VWR International, LLC	66022-060	Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner
4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz	Dot Scientific, Inc.	6759-200
Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth	VWR International, LLC	89043-554	Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached
Standar-Grade Glass Beaker, 250 mL Capacity	VWR International, LLC	173506
Beakers, PTFE	VWR International, LLC	89026-022	For use with HF
Shallow form watch glass, 3"	VWR International, LLC	66112-107	Case of 12
Plastic Storage Container	VWR International, LLC	470195-354	For secondary container
General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers	VWR International, LLC	89095-564
High precision and ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences	78310-0
Polycarbonate Faceshield	Fisher Scientific, Inc.	18-999-4542
Neoprene Apron	Fisher Scientific, Inc.	19-810-609
Calcium Gluconate, Calgonate	W.W Grainger, Inc.	13W861	Tube, 25 g
Hydrogen Peroxide 30 % CR ACS 500 mL	Fisher Scientific, Inc.	H325 500	HARMFUL, TOXIC
3-Aminopropyltriethoxysilane	Gelest Inc.	SIA0610.0-25GM	Let warm to room temperature before use.
Ammonium hydroxide, 2.5 L	Fisher Scientific, Inc.	A669-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid	Fisher Scientific, Inc.	A144-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrofluoric acid	Fisher Scientific, Inc.	A147-1LB	HARMFUL, TOXIC
MultiMode Nanoscope IIIa	Veeco Instruments, Inc.	n/a	Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis
Dunk basket	Made in lab	Made in lab	The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws.