Préparation de Mica et Silicon substrats pour l'ADN Origami Analyse et Expérimentation

Summary

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Abstract

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Introduction

D'abord présenté en 2006, l'ADN origami utilise la nature d'auto-assemblage d'oligonucléotides d'ADN pour produire des nanostructures concevables et très ordonnées. ¹ Une myriade de structures ont été signalés, allant de smiley face à verrouillée boîtes 3 ​​dimensions. ² ADN origami peut être fonctionnalisés avec diverses biomolécules et nanostructures, donnant lieu à des applications de recherche en nanoélectronique, la médecine et l'informatique quantique. ³ Cependant, l'analyse et de nombreuses applications futures ne sont pas seulement tributaire de la conception structurelle, mais aussi sur l'adhésion des nanostructures d'ADN origami à des surfaces. Les méthodes décrites dans ce manuscrit ont trait à la préparation des échantillons d'origami d'ADN sur deux types de supports: mica et d'oxyde de silicium fonctionnalisés.

Mica est le substrat de choix pour les études de l'ADN origami parce qu'il est atomiquement plat, avec une hauteur de couche de 0,37 nm ± 0,02 nm. ⁴ Il est également EASily nettoyé, ce qui rend la préparation des échantillons et de la microscopie à force atomique (AFM) des études simple. Mica moscovite contient une densité élevée de potassium dans chaque plan de clivage, mais ces ions diffuse loin de la surface du mica lorsque dans l'eau. Pour la médiation de la liaison de l'ADN origami pour le substrat de mica, Mg ²⁺ est utilisée pour inverser la charge négative du mica et de lier électrostatique du phosphate d'ADN épine dorsale du substrat (figure 1A). ⁵ mélanges d'ADN recuit en présence d'un grand excès de brins de base donnent une couverture élevée et de bonnes images de mica, car l'adhérence de l'ADN origami à la surface Mg ²⁺ à terminaison est beaucoup plus forte que l'adhérence d'oligonucléotides simple brin (brins de base). D'autres ions chargés positivement, y compris Ni ²⁺ et Co ²⁺ peuvent être utilisés pour contrôler l'adhérence de l'ADN sur du mica. ^6,7 Modification de la concentration de cations monovalents et divalents dans la solution peut servir de médiateur adhésion et de diffusion de surface taux d'ADN origami. ⁸ Cependant, le protocole de préparation des substrats de mica et de dépôt et rinçage de la origami est souvent pas explicitement décrits dans les manuscrits publiés. ⁹ Sans un protocole clair, des résultats reproductibles peuvent être difficiles à obtenir.

Mica est un isolant, de sorte qu'il ne convient pas en tant que substrat pour certaines applications en nanoélectronique. Silicon passive avec un oxyde natif mince possède des propriétés électroniques souhaitables, y compris la compatibilité avec le traitement préalable gratuit semi-conducteurs à oxyde métallique (CMOS) pour créer / structures d'entrée-sortie et les caractéristiques topographiques. Les plaquettes de silicium stockées dans l'air sont passivées avec soit un oxyde thermique d'épaisseur ou d'un film d'oxyde natif mince qui est relativement sale, avec un nombre élevé de particules. L'oxyde de silicium a une densité de charge de surface beaucoup plus faible que le mica, et la densité de charge est très dépendante de la préparation de l'oxyde et de l'histoire. À des concentrations en ions magnésium above 150 mM, de bonnes couvertures (jusqu'à 4 / um ²⁾ de l'origami d'ADN rectangulaire peut être réalisé sur l'oxygène plasma traité substrats de silicium; Cependant, cette concentration et la couverture peuvent varier selon la taille et la conception des nanostructures utilisé. ¹⁰ Un protocole alternatif pour accorder la charge de surface est d'attacher une monocouche auto-assemblée cationique de 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) (figure 1B) à l'oxyde. L'aminé primaire sur APTES peut être protoné à un pH inférieur à 9, en modifiant la charge et le caractère hydrophobe du substrat. ¹¹ Pour une monocouche complète de APTES être déposé avec succès, le silicium doit être nettoyé de manière appropriée en utilisant Radio Corporation of America (RCA) protocoles . Ces protocoles comprennent des traitements de l'hydroxyde d'ammonium et des solutions de peroxyde d'hydrogène (RCA1) pour éliminer les résidus organiques et les contaminants particulaires. Un court gravure dans une solution aqueuse d'acide fluorhydrique enlève la couche d'oxyde natif avectous les contaminants ioniques qui adhèrent à l'oxyde. Enfin, les échantillons sont exposés à de l'acide chlorhydrique et de solution de peroxyde d'hydrogène (RCA2) pour éliminer les métaux et les contaminants ioniques et former une couche mince et uniforme d'oxyde. ¹² La plupart des salles blanches ont désigné les hottes de protocoles de nettoyage CMOS, avec des règles strictes sur ce qui peut être utilisé dans ces domaines. Un problème commun est livré sous la forme d'ions tels que le sodium, qui peuvent perturber les propriétés électroniques des structures CMOS en créant des pièges midbandgap. ¹³ Ions couramment utilisé dans l'ADN origami préparation et de dépôt des tampons pourrait contaminer les bains CMOS et causer des problèmes pour d'autres chercheurs utilisant la chambre propre. Pour cette raison, notre groupe utilise un CMOS «sales» banc de nettoyage disposés spécifiquement pour les petits échantillons utilisés pour la recherche de l'ADN origami. Ce processus est une bonne alternative à la salle blanche traditionnelle set-up et peut convenir pour les laboratoires qui ne disposent pas de l'accès à un banc CMOS de salle blanche.

Protocol

1. Expérience Planification et préparation Matériel Déterminer la conception, de la concentration, et la fonctionnalité de l'origami d'ADN qui sera utilisé dans les expériences. 14-16 Ici, nous utilisons un design ADN origami rectangle préparés 1x TAE / Mg 2+ solution (40 mM Tris-base 20 mM l'acide acétique, 2 mM d'EDTA et 12 mM d'acétate de magnésium, pH 8,0). 17 Autoclave tous les bons plans, des tubes et des récipients pour être u…

Representative Results

Deux variables dictent la couverture de l'ADN origami sur le substrat: concentration de la solution et de la durée d'exposition. Les caractéristiques d'adsorption de l'ADN origami sur le mica et APTES oxyde de silicium fonctionnalisés ont été précédemment rapporté. 13 La relation entre la concentration de l'ADN origami dans la solution de dépôt et les couvertures finales sur le mica sont résumées dans le tableau 1 et figure 2, montrant de plus …

Discussion

Il ya plusieurs étapes qui doivent être souligné pour atteindre des résultats cohérents et idéales. Pour les échantillons de mica, après un rinçage stricte et approfondie et de séchage régime, comme dans les étapes 3.3 et 3.4, fera en sorte que des images de haute qualité de personne origami d'ADN peuvent être atteints en utilisant l'AFM sans les divers problèmes décrits dans la section des résultats représentatifs. D'une importance primordiale pour des échantillons de silicium est la prop…

Materials

Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μL	VWR International, LLC	22491733	10 reload tray of 96 tips
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR International, LLC	87003-290	0.65 mL, natural
Research Plus Pippete – Single Channel – 20-200 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960F-3120000054 EACH	Adjustable Volume
Research Plus Pippete – Single Channel – 2-20 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960D-3120000038 EACH	Adjustable Volume
Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape	Office Depot, Inc.	602710	3/4" x 300", Pack of 2
Vortex Mixer	Thermo Scientific	M37610-33Q
Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm	Electron Microscopy Sciences	64917-2	6 per pack
6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat	Nova Electronic Materials, Ltd.	GC49266
Powder-Free Nitrile Examination Gloves	VWR International, LLC	82062-428	Catalog number is for size large
High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating	K-Tek Nanotechnology, Inc.	HA_NC/15
Autoclave Pan	A. Daigger & Company, Inc.	NAL692-5000 EF25341C
Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch – 1 dz	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	106-15055	Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves.
Tweezers PTFE 200 mm Square	Dynalon Corp.	316504-0002
Muscovite Mica Sheets V-5 Quality	Electron Microscopy Sciences	71850-01	10 per pack
Mica Disc, 10 mm	Ted Pella, Inc	50	Mica discs are optional
Scriber Diamon Pen for Glassware	VWR International, LLC	52865-005
Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap – 20 mL	VWR International, LLC	66022-060	Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner
4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz	Dot Scientific, Inc.	6759-200
Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth	VWR International, LLC	89043-554	Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached
Standar-Grade Glass Beaker, 250 mL Capacity	VWR International, LLC	173506
Beakers, PTFE	VWR International, LLC	89026-022	For use with HF
Shallow form watch glass, 3"	VWR International, LLC	66112-107	Case of 12
Plastic Storage Container	VWR International, LLC	470195-354	For secondary container
General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers	VWR International, LLC	89095-564
High precision and ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences	78310-0
Polycarbonate Faceshield	Fisher Scientific, Inc.	18-999-4542
Neoprene Apron	Fisher Scientific, Inc.	19-810-609
Calcium Gluconate, Calgonate	W.W Grainger, Inc.	13W861	Tube, 25 g
Hydrogen Peroxide 30 % CR ACS 500 mL	Fisher Scientific, Inc.	H325 500	HARMFUL, TOXIC
3-Aminopropyltriethoxysilane	Gelest Inc.	SIA0610.0-25GM	Let warm to room temperature before use.
Ammonium hydroxide, 2.5 L	Fisher Scientific, Inc.	A669-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid	Fisher Scientific, Inc.	A144-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrofluoric acid	Fisher Scientific, Inc.	A147-1LB	HARMFUL, TOXIC
MultiMode Nanoscope IIIa	Veeco Instruments, Inc.	n/a	Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis
Dunk basket	Made in lab	Made in lab	The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws.