הכנת מצעים נציץ והסיליקון לDNA אוריגמי ניתוח וניסויים
Summary
Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.
Abstract
The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.
Introduction
הוצג לראשונה בשנת 2006, אוריגמי DNA מנצל את הטבע להרכבה העצמית של oligonucleotides DNA לייצר ננו designable והורה מאוד. 1 מספר עצום של מבנים דווח, החל סמיילי פרצופים לנצמד תיבות 3 ממדים. 2 אוריגמי DNA יכול להיות פונקציונליות עם מולקולות ביולוגיות שונות וננו, והוליד יישומי מחקר בnanoelectronics, רפואה, ומחשוב קוונטים. 3 עם זאת, הניתוח ויישומים רבים בעתיד הם לא רק תלוי בעיצוב מבני, אלא גם על ההידבקות של ננו אוריגמי DNA למשטחים. השיטות שתוארו בכתב היד הזה נוגעים להכנת דגימות DNA אוריגמי על שני סוגים של מצעים: נציץ ותחמוצת סיליקון פונקציונליות.
מיכה הוא המצע של בחירה ללימודי אוריגמי DNA כי זה אטומי שטוח, עם גובה שכבה של 0.37 ננומטר ± 0.02 ננומטר. 4 זה גם EASאילי ניקה, מה שהופך את הכנת מדגם ומחקרים במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) פשוטות. נציץ מוסקבאי מכיל צפיפות גבוהה של אשלגן בכל מטוס מחשוף, אבל יונים אלה מפוזר מהמשטח נציץ כאשר במים. לתווך המחייב של אוריגמי DNA למצע נציץ, Mg 2 + משמש כדי להפוך את המטען השלילי של המיקה ואלקטרוסטטי לחייב את עמוד השדרה פוספט DNA למצע (איור 1 א). 5 תערובות של DNA מרותק בנוכחות גדולה קיצוניות של גדילי מצרך לתת כיסוי גבוה ותמונות טובות בתציץ בגלל ההידבקות של אוריגמי DNA למשטח Mg 2 + -terminated היא הרבה יותר חזקה מההידבקות של oligonucleotides חד-גדילים (גדילי מצרך). יונים טעונים חיובי אחרים, כוללים Ni 2 + 2 + Co וניתן להשתמש בם כדי לשלוט בהדבקה של ה- DNA ביציץ. 6,7 שינוי הריכוז של קטיונים חד ערכי ודו ערכיים בפתרון יכול לתווך adheשיעורי שיאון ודיפוזיה פני השטח של אוריגמי DNA. 8 עם זאת, הפרוטוקול להכנת מצעים נציץ והפקדה ושטיפת אוריגמי לעתים קרובות אינו מתוארים בכתבי יד שפורסם. 9 במפורש ללא פרוטוקול ברור, תוצאות לשחזור יכולים להיות קשות להשגה.
מיכה הוא מבודד, כך שזה לא מתאים כמצע ליישומים מסוימים בnanoelectronics. יש סיליקון פסיבציה עם תחמוצת יליד דקה מאפיינים אלקטרוניים רצויים, כולל תאימות עם עיבוד לפני metal-oxide semiconductor חינם (CMOS) כדי ליצור קלט / פלט מבנים ותכונות טופוגרפיות. פרוסות סיליקון המאוחסנות באוויר פסיבציה גם עם תחמוצת תרמית עבה או סרט תחמוצת ילידים דק שהוא יחסית מלוכלך, עם ספירת חלקיקים גבוהה. יש תחמוצת הסיליקון צפיפות מטען משטח נמוכה בהרבה מיציצו, וצפיפות המטען תלויה מאוד בהכנת תחמוצת והיסטוריה. במגנזיום ריכוזי יון ABOיש 150 מ"מ, כיסויים טובים (עד 4 / מיקרומטר 2) של אוריגמי DNA המלבני יכול להיות מושגת על מצעי סיליקון פלזמה טופלה חמצן; עם זאת, ריכוז והכיסוי עשוי להשתנות בהתאם לגודל והעיצוב של ננו בשימוש. 10 פרוטוקול חלופי לכוונון תשלום פני השטח הוא לצרף monolayer עצמי התאספו קטיוני של 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) (איור 1) ל תחמוצת. האמין העיקרית בAPTES ניתן protonated בערכי pH מתחת ל -9, שינוי החיוב והידרופוביות של המצע. 11 לmonolayer של APTES שלם שיופקדו בהצלחה, סיליקון יש לנקות כראוי באמצעות תאגיד רדיו של אמריקה פרוטוקולים (RCA) . פרוטוקולים אלה כוללים טיפולים באמוניום הידרוקסיד ופתרונות מי חמצן (RCA1) כדי להסיר שאריות אורגניות ומזהמים חלקיקים. לחרוט קצר בפתרון חומצה הידרופלואורית המימי מסיר את שכבת תחמוצת ילידים יחד עםכל מזהמים יוניים שלדבוק תחמוצת. לבסוף, דגימות חשופות לחומצה הידרוכלורית ופתרון מי חמצן (RCA2) כדי להסיר מתכת וזיהום יוני וליצור שכבת תחמוצת דקה, אחידה. 12 רוב החדרים נקיים שמיועדים ברדסים לפרוטוקולי ניקוי CMOS, עם כללים נוקשים לגבי מה ניתן להשתמש באזורים אלה. בעיה נפוצה מגיעה בצורה של יונים כמו נתרן, שיכול לשבש את המאפיינים האלקטרוניים של מבני CMOS על ידי יצירת מלכודות midbandgap. משמש 13 יונים נפוצים במאגרי הכנה ותצהיר אוריגמי DNA יכול לזהם את אמבטיות CMOS ולגרום לבעיות לחוקרים אחרים באמצעות החדר הנקי. מסיבה זו, הקבוצה שלנו משתמשת CMOS 'המלוכלך' ניקוי ספסל מסודר במיוחד עבור המדגמים הקטנים המשמשים למחקר אוריגמי DNA. תהליך זה הוא אלטרנטיבה טובה להגדרת החדר הנקי המסורתית ועשוי להיות מתאים למעבדות שאין להם גישה לספסל CMOS החדר הנקי.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר צעדים שצריכים להדגיש להשגת תוצאות עקביות ואידיאליות. עבור דגימות נציץ, הבא שטיפה קפדנית ויסודית וייבוש משטר, כמו בשלבים 3.3 ו 3.4, יבטיח שתמונות באיכות גבוהה של אוריגמי DNA הבודד ניתן להשיג באמצעות AFM ללא הבעיות השונות המפורטים בסעיף נציגי תוצאות. חשיבות העיקרי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Gary Bernstein for use of the AFM.
Materials
| Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μL | VWR International, LLC | 22491733 | 10 reload tray of 96 tips |
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR International, LLC | 87003-290 | 0.65 mL, natural |
| Research Plus Pippete – Single Channel – 20-200 μL | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960F-3120000054 EACH | Adjustable Volume |
| Research Plus Pippete – Single Channel – 2-20 μL | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960D-3120000038 EACH | Adjustable Volume |
| Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape | Office Depot, Inc. | 602710 | 3/4" x 300", Pack of 2 |
| Vortex Mixer | Thermo Scientific | M37610-33Q | |
| Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm | Electron Microscopy Sciences | 64917-2 | 6 per pack |
| 6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat | Nova Electronic Materials, Ltd. | GC49266 | |
| Powder-Free Nitrile Examination Gloves | VWR International, LLC | 82062-428 | Catalog number is for size large |
| High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating | K-Tek Nanotechnology, Inc. | HA_NC/15 | |
| Autoclave Pan | A. Daigger & Company, Inc. | NAL692-5000 EF25341C | |
| Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch – 1 dz | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 106-15055 | Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves. |
| Tweezers PTFE 200 mm Square | Dynalon Corp. | 316504-0002 | |
| Muscovite Mica Sheets V-5 Quality | Electron Microscopy Sciences | 71850-01 | 10 per pack |
| Mica Disc, 10 mm | Ted Pella, Inc | 50 | Mica discs are optional |
| Scriber Diamon Pen for Glassware | VWR International, LLC | 52865-005 | |
| Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap – 20 mL | VWR International, LLC | 66022-060 | Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner |
| 4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz | Dot Scientific, Inc. | 6759-200 | |
| Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth | VWR International, LLC | 89043-554 | Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached |
| Standar-Grade Glass Beaker, 250 mL Capacity | VWR International, LLC | 173506 | |
| Beakers, PTFE | VWR International, LLC | 89026-022 | For use with HF |
| Shallow form watch glass, 3" | VWR International, LLC | 66112-107 | Case of 12 |
| Plastic Storage Container | VWR International, LLC | 470195-354 | For secondary container |
| General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers | VWR International, LLC | 89095-564 | |
| High precision and ultra fine tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78310-0 | |
| Polycarbonate Faceshield | Fisher Scientific, Inc. | 18-999-4542 | |
| Neoprene Apron | Fisher Scientific, Inc. | 19-810-609 | |
| Calcium Gluconate, Calgonate | W.W Grainger, Inc. | 13W861 | Tube, 25 g |
| Hydrogen Peroxide 30 % CR ACS 500 mL | Fisher Scientific, Inc. | H325 500 | HARMFUL, TOXIC |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Gelest Inc. | SIA0610.0-25GM | Let warm to room temperature before use. |
| Ammonium hydroxide, 2.5 L | Fisher Scientific, Inc. | A669-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific, Inc. | A144-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrofluoric acid | Fisher Scientific, Inc. | A147-1LB | HARMFUL, TOXIC |
| MultiMode Nanoscope IIIa | Veeco Instruments, Inc. | n/a | Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis |
| Dunk basket | Made in lab | Made in lab | The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws. |
Referências
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Anderson, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459, 73-77 (2009).
- Wang, Z., Ding, B. Engineering DNA Self-Assemblies as Templates for Functional Nanostructures. Acc. Chem. Res. 47, 1654-1662 (2014).
- Xu, K., et al. Graphene Visualizes the First Water Adlayers on Mica at Ambient Conditions. Science. 329, 1188-1191 (2010).
- Bustamante, C., et al. Circular DNA-molecules imaged in air by scanning force microscopy. Bioquímica. 31, 22-26 (1992).
- Hsueh, C., et al. Localized Nanoscopic Surface Measurements of Nickel-Modified Mica for Single-Molecule DNA Sequence Sampling. ACS Appl Mater. Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Pastre, D., et al. Anionic polyelectrolyte adsorption on mica mediated by multivalent cations: A solution to DNA imaging by atomic force microscopy under high ionic strengths. Langmuir. 22, 6651-6660 (2006).
- Woo, S., et al. Self-assembly of two-dimensional DNA origami lattices using cation-controlled surface diffusion. Nature Communications. 5, 4889 (2014).
- Vesenka, J., et al. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope. Ultramicroscopy. 42-44, 1243-1249 (1992).
- Albrechts, B., et al. Adsorption studies of DNA origami on silicon dioxide. , (2010).
- Sarveswaran, K., et al. Adhesion of DNA Nanostructures and DNA Origami to lithographically patterned self-assembled monolayers in Si[100]. Proc. of SPIE-Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M-1 (2010).
- Kern, W., Puotien, D. A. Cleaning solutions based on hydrogen peroxide for use in silicon semiconductor technology. RCA Rev. 31, 187-206 (1970).
- Pillers, M., Goss, V., Lieberman, M. Electron-Beam Lithography and Molecular Liftoff for Directed Attachment of DNA Nanostructures on Silicon: Top-down Meets Bottom-up. Acc. Chem. Res. 47, 1759-1767 (2014).
- Saccá, B., Niemery, C. M. DNA Origami: The Art of Folding DNA. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 58-66 (2012).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., et al. Designing a Bio-responsive Robot from DNA. Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268 (2013).
- Woo, S., et al. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nature Chemistry. 3, 620-627 (2011).
- Schlegel, M. L., et al. Cation sorption on the muscovite (001) surface in chloride solutions using high-resolution X-ray reflectivity. Geochim. Cosmochim. Acta. 70, 3549-3565 (2006).
- Rasband, W. S., Howarter, J. A., et al. National Institutes of Health. Langmuir. 22, 11142-11147 (2006).
- Kershner, R. J., et al. Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces. Nature Nanotechnology. 4, 557-561 (2009).
- Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5, 121-126 (2010).
- Sarveswaran, K., et al. et al.Adhesion of DNA nanostructure and DNA origami to lithographically patterned self-assembled monolayers on Si[100. Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M (2010).
- Pillers, M. A., Lieberman, M. Thermal stability of DNA origami on mica. J. Vac. Sci. Technol. B. 32, 040602 (2014).
- Song, J., et al. Direct Visualization of Transient Thermal Response of a DNA. Origami. J. Am. Chem. Soc. 134, 9844 (2012).
- Wei, X., et al. Mapping the thermal behavior of DNA origami nanostructures. J. Am. Chem. Soc. 135 (16), 6165-6176 (2013).
- Hyojeong Kim, ., et al. Stability of DNA Origami Nanostructures under Diverse Chemical Environments. Chem. Mater. 26, 5265-5273 (2014).
