生理活性、PCLベースの「セルフフィット」形状記憶ポリマー足場の作製
Summary
Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.
Abstract
Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.
Introduction
現在、頭蓋顎顔面（CMF）骨欠損治療のゴールドスタンダードと考えられ、収穫自家移植片の移植は複雑な移植手順、ドナー部位の罹患率と限られた可用性1によって妨げられています。特定の困難は、オッセオインテグレーションを得るために、グラフトの再吸収を防止するために、欠陥にしっかり剛性自家移植片を成形し、固定されています。組織工学は、自家移植の代替戦略と合成骨代替物（ 例えば、骨セメント）-2,3-として研究されてきました。組織工学的アプローチの成功に重要なプロパティの特定のセットとの足場です。まず、オッセオインテグレーションを得るために、足場は、隣接する骨組織4との密接な接触を形成しなければなりません。足場はまた、細胞移動、栄養拡散とneotissue堆積4,5を可能にして、骨伝導性でなければなりません。この動作は、一般的に、生分解性、SCAで達成されます高度に相互接続孔の形態を呈するffolds。骨組織5を周囲との統合との結合を促進するために、最後に、足場は、生物活性であるべきです。
ここでは、これらの特性を持つ組織工学の足場を準備するためのプロトコルを提示します。重要なことには、この足場は、形状記憶挙動6による不規則なCMF欠陥に「自己適合」する能力を示します。温度応答性形状記憶ポリマー（SMPS）は、7,8の熱への暴露時に形状変化を起こすことが知られています。 SMPSが永続的形状および一時的形状を維持し、永続的形状を回復する「スイッチングセグメントを「決定」netpoints」（ すなわち 、化学的または物理的架橋）から構成されています。スイッチングセグメントはガラス転移（T g）のいずれかに相当する熱転移温度（T トランス）を示すか、ポリマーの転移（T mを）溶かします。として結果は、SMPSが順次T <T トランスで一時的な形状に固定し、T> T トランスでの一時的な形状に変形し、T> T トランスで永続的形状に回復することができます。 6を次のようにこのように、SMP足場は、CMFの欠損内に「自己フィッティング」を達成できました。生理食塩水（T> T トランス）を温めるに暴露した後、SMP足場は、形状回復が不良境界に足場の拡大を推進して、凹凸欠陥に手で押したように一般的に準備された円筒状の足場を許可する、可鍛性になります。 （T <T トランス）を冷却すると、足場は形状固定性が欠損内に、新しい一時的な形状を維持しながら、その比較的より剛性の状態に戻ることになります。このプロトコルでは、SMPの足場は、生分解性ポリマーは、組織再生、および他の生物医学的用途のために広く研究9-11、ポリカプロラクトン（PCL）から調製されます。形状記憶のために、目PCLのEのT mは、T トランスとして機能し、PCL 12の分子量に応じて、43〜60ºCの間で変化します。このプロトコルでは、足場のT トランス （ すなわち T m）は56.6±0.3ºC6です。
骨伝導性を達成するために、プロトコルは、溶媒キャスティング微粒子浸出（SCPL）法6,13,14に基づいて高度に相互接続された細孔を有するPCLベースSMP足場を作るために開発されました。ポリカプロラクトンジアクリレート（PCL-DA）（M = N〜10,000グラム/モル）を急速な、光化学的な架橋を可能にするために利用された塩のテンプレート上溶剤キャストを可能にするために、ジクロロメタン（DCM）に溶解しました。光化学硬化、溶媒の蒸発の後、塩のテンプレートを水に浸出することによって除去しました。平均塩サイズは足場の細孔サイズを調節します。重要なことには、塩テンプレート前細孔interconnectiviを達成するために、キャスティング溶媒を水と融合しましたTY。
生物活性は、細孔壁6上にポリドーパミンコーティングのその場形成のことで、SMPの足場に付与しました。生物活性は、多くの場合、ガラスまたはガラス-セラミック充填材15を含めることによって足場に導入されます。しかし、これらは、望ましくない脆性、機械的特性を生じ得ます。ドーパミンは、基板16〜19の様々な上に付着し、薄いポリドーパミン層を形成することが示されています。このプロトコルでは、SMPの足場は、すべての細孔壁面6にポリドーパミンのnanothickコーティングを形成するためにドーパミンのわずかに塩基性液（pH = 8.5）に供しました。改善された細胞接着のための表面の親水性を向上させ、拡散に加えて、ポリドーパミンは、擬似体液（SBF）18,20,21への曝露の際に、ハイドロキシアパタイト（HAP）を形成するという点で生物活性であることが示されています。最後のステップでは、コートされた足場は、85ºC（T> T トランス）WHで熱処理を露出させますICHは、足場の高密度化につながります。熱処理は、以前おそらく近接14に再編成するPCLの結晶ドメインに、足場形状記憶動作のために必須であることが認められました。
我々はさらに、孔の形態を、不規則なモデル欠陥内のセルフフィット挙動を特徴づけるための方法を記載するという点でひずみ制御環状の熱機械的圧縮試験を形状記憶挙動（ すなわち形状回復と定着性を形作る）、 および in vitro生物活性に 。足場の特性を調整するための戦略も提供されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、自己フィッティング行動だけでなく、骨誘導性および生物活性ポリドーパミン被覆された、PCLベースの足場の製造を記載し、不規則なCMFの骨欠損の治療に関心のそれを作ります。プロトコルの態様は、様々な骨格の機能を変更するために変更することができます。
プロトコルは、UV硬化を可能にするために、PCLジオールのアクリルから始まります…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、テキサスA＆M大学のエンジニアリングに感謝し、本研究の財政支援のためのステーション（TEES）を実験します。リンジーネイルは感謝して少数の参加のためのテキサスA＆M大学のルイ・ストークス・アライアンス（LSAMP）と国立科学財団（NSF）大学院研究フェローシッププログラム（GRFP）からの支援を認めています。偉張のおかげで、テキサスA＆M大学論文フェローシップ。
Materials
| Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Dried over 4A molecular sieves |
| 4-dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
| Triethylamine (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Acryloyl chloride | Sigma-Aldrich | A24109 | |
| Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| Potassium Carbonate (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher | M65 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Dopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | |
| Tris buffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Used at 10 mM concentration, pH = 8.5 |
| Sieve | VWR | 47729-972 | |
| UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | FEI | Quanta 600 |
Referências
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