Solid Lipid nanoparticelle (linfonodi sentinella) Applicazioni per intracellulare targeting

Summary

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Abstract

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Introduction

Veicoli di consegna basata nanoparticelle hanno mostrato una grande promessa per le applicazioni destinate intracellulari, fornendo un meccanismo per alterare specificamente segnalazione cellulare e l'espressione genica. Questi veicoli possono essere caricati con farmaci, proteine ​​e acidi nucleici progettati per influenzare la risposta cellulare e ottenere un effetto desiderato nei tessuti bersaglio. Molti tipi di nanovettori sono stati esplorati per beneficio terapeutico e diagnostica compresi lipidi, polimeri, silicio e materiali magnetici. Questi sistemi sono interessanti per la loro potenziale per la consegna della droga localizzato, aumento della concentrazione terapeutica nei tessuti bersaglio, e la riduzione della tossicità sistemica.

Nanoparticelle lipidiche solide (linfonodi sentinella) sono un esempio ben studiato di un sistema di erogazione di nanoparticelle che è emerso come un veicolo di consegna promettente farmaco negli ultimi anni. Linfonodi sentinella possono essere facilmente formulati per molteplici applicazioni tra cui bio-sensing ^1, cosmetici ^2, e tconsegna herapeutic ^3-7. La loro utilità deriva dal fatto che essi sono costituiti interamente da riassorbibili, lipidi non tossici, con conseguente maggiore biocompatibilità. Durante la sintesi, farmaci lipofili possono essere incorporati in veicoli SLN, aumentando così la solubilità e l'idoneità farmaco per somministrazione parenterale. Veicoli SLN anche aiutare a stabilizzare terapeutica incapsulati, riducendo la loro degradazione e di liquidazione, e massimizzando azione terapeutica. Questi veicoli sono particolarmente adatti per lunga durata d'azione, le preparazioni a rilascio controllato per la loro stabilità alle ^3,4,8,9 temperatura corporea. È importante sottolineare che l'incapsulamento dei farmaci in nanoparticelle lipidiche altera i profili farmacocinetici intrinseche delle molecole di droga. Ciò fornisce un vantaggio potenziale permettendo il rilascio controllato di farmaci con un ristretto indice terapeutico. Il tasso di rilascio di terapie SLN-incorporato può essere sintonizzato sulla base del tasso di degradazione dei lipidi o il tasso di diffusione della droga nelmatrice lipidica.

Linfonodi sentinella sono spesso progettati ad accumularsi nei tessuti bersaglio specifici. Ad esempio, le loro dimensioni (tipicamente maggiore di 10 nm) potenzia ritenzione nella circolazione, dove la vascolarizzazione del tessuto tumorale leaky facilita la deposizione. Inoltre, la via di somministrazione particella ha dimostrato di alterare biodistribuzione con la possibilità di indirizzare specifiche strutture fisiologiche quali linfonodi ^10,11. Dopo la deposizione nei tessuti bersaglio, ottenendo adeguate interazioni cellulari ed eventuale internalizzazione delle nanoparticelle è difficile a causa della capacità delle membrane cellulari per controllare selettivamente il flusso di ioni e molecole dentro e fuori della cella ^12. Per facilitare assorbimento cellulare, è possibile modificare nanovettori con leganti specifici inclusi peptidi, piccole molecole, e anticorpi monoclonali ^13,14. Diversi meccanismi compresi sia penetrazione passivo e trasporto attivo di nanoparticelleattraverso la membrana cellulare precedentemente descritte ^3,12,15. In generale, è stato dimostrato che le interazioni cellula-nanoparticelle sono influenzati dalle proprietà fisico-chimiche delle nanoparticelle tra cui le dimensioni, la forma, carica superficiale e chimica di superficie, oltre ai parametri specifici delle cellule, quali tipo di cellula o cella fase del ciclo ^12.

Una precedente inchiesta ha dimostrato la sintesi di sub-10 nm linfonodi sentinella per uso topico ¹⁶ e biomarcatori applicazioni di rilevamento ¹ con il metodo del ¹⁷ temperatura di inversione di fase (PIT). Questo è un metodo di sintesi in cui delicato ² la composizione rimane costante mentre la temperatura viene gradualmente cambiata. Continua agitazione della soluzione riscaldata, mentre si raffredda a risultati RT in una nanoemulsione. Questo processo determina la sintesi di linfonodi sentinella con granulometria inferiore ¹ di quella precedentemente riportata utilizzando vari metodi per la sintesi di lipidi nanoparticles ^17-22. La scala di dimensioni risulta, a meno di 20 nm, offre un vantaggio per le applicazioni di targeting intracellulare a causa di una maggiore superficie e il potenziale di interazioni cellulari avanzati.

Uno schema di linfonodi sentinella, destinata a fornire un colorante fluorescente o terapeutico, è mostrata in Figura 1. I linfonodi sentinella costituiti da un lipide interni (ad esempio, alcano lineare) permettendo l'incorporazione di composti lipofili (ad esempio, coloranti o terapeutici) e un esterno tensioattivo (tensioattivo non ionico ad esempio, lineare) circondato da acqua. In questo studio, linfonodi sentinella sono stati caricati con un colorante fluorescente e usati come modello per studiare le interazioni delle particelle-cellula. Fibroblasti dermici umani primari e le cellule dendritiche di topo sono state esposte per tingere-caricato SLN nel tempo al fine di caratterizzare le interazioni in termini di tossicità e l'assorbimento delle particelle. Un test 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylphenyltetrazolium bromuro (MTT) era Utilized al fine di stabilire adeguati livelli di dosaggio. Microscopia a fluorescenza e citometria a flusso sono stati due metodi utilizzati per esaminare l'assorbimento delle particelle in vitro.

Figura 1. Schema del linfonodo sentinella che mostra i principali componenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Il trattamento di linfonodi sentinella Sintesi di linfonodi sentinella Nota: Utilizzare il metodo PIT 1,17,20 per preparare i sub-20 nm linfonodi sentinella 1. Utilizzare una tecnica asettica, bioreagents o reagenti di colture cellulari di qualità e materiali sterili (cioè, pipette, spatole, fiale, ecc.) Utilizzare un armadio biosicurezza per la sintesi dei linfonodi sentinella (Figura 2). Combinare 0,6 mg di col…

Representative Results

Il metodo è stato utilizzato PIT per sintetizzare i linfonodi sentinella e la temperatura di inversione di fase è stato determinato utilizzando un bagno di acqua. I campioni erano riscaldata lentamente e delicatamente agitata finché la soluzione appariva chiaro. La temperatura inversione di fase per i linfonodi sentinella effettuate utilizzando lipidi heneicosane è di 45 ° C. La tabella 1 riassume la dimensione delle particelle, polidispersità, punto di fusione e calore latente di fusione per i li…

Discussion

In questo studio, la sintesi di linfonodi sentinella e loro applicabilità per le applicazioni destinate intracellulari sono state esplorate. Queste nanoparticelle biocompatibili hanno mostrato risultati promettenti come veicoli di consegna per più applicazioni, tra cui la somministrazione di farmaci, silenziamento genico, e le tecnologie di vaccini ^25-30. Ultra-piccoli linfonodi sentinella sono stati sintetizzati utilizzando un processo facile, e sono state esplorate le loro interazioni con le cellule della…

Materials

Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo	—-	Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3,[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	—-	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	R&D Systems	415	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	R&D Systems	404	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.