Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.
The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.
De colon epitheel is een sterk regeneratief weefsel, met ingezeten stamcellen aanvullen van het weefsel om de paar dagen 1. Dit proces van regeneratie vereist het handhaven van een proliferatieve stamcelcompartiment. Na verloop van tijd, de nieuw geproduceerde dochtercellen verliezen hun proliferatieve potentie en migreren naar het luminale oppervlak van de darmen. Samenvalt met de migratie, stamcellen differentiëren in mature-barrière vormen enterocyten of slijm produceren slijmbekercellen. Niet van differentiëring programma wordt verondersteld bij te dragen aan epitheliale barrière gecompromitteerd zoals wordt waargenomen bij inflammatoire darmziekten en darmkanker 2,3.
Studie van de bovenstaande werkwijzen zal methoden voor het isoleren crypt-base en oppervlak celpopulaties vereisen. Meerdere methoden bestaan, elk met unieke voordelen en nadelen. Huidige werkwijzen voor het isoleren van darmepitheelcellen omvatten chelating middelen en mechanische dissociatie, resulterend in de isolatie van hele crypten, epitheelvellen of enkele cellen, afhankelijk van experimentele omstandigheden 4,5. Dit zijn hoge opbrengst methoden, nog veranderingen in intercellulaire signalering gerapporteerd onder deze omstandigheden die niet de eigen omgeving 6,7 kunnen vertegenwoordigen. Lasermicrodissectie zorgt voor de verzameling ruimtelijke verschillende materiaal, maar behaalt laag moleculair opbrengst 8,9. In humaan dikke darmweefsel, zijn periodieke horizontale cryosectioning werkwijzen ontwikkeld 10. Echter, muizen slijmvliezen zijn onbetaalbaar klein voor directe bestemming van deze techniek. Bij mensen intestinale crypte lengte (de afstand tussen de crypte-base en huidcellen) in de dikke darm varieert tussen 100-1000 pm ~ 11. In muizen, crypt lengten tussen ~ 50-300 micrometer (zie figuur 1A). De geringe omvang van muizen crypten vormt een uitdaging voor de isolatie van deze twee celpopulaties met behulp van bestaande protocollen.
We beschrijven nu een goedkope, hoge opbrengst methode voor het isoleren van crypte-base en oppervlakte epitheliale celpopulatie in muriene darmweefsel. Weefsel geoogst op deze wijze kunnen dan worden geanalyseerd door een aantal standaard downstreamtoepassingen, zoals immunofluorescentie kleuring, RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction) of western blotting.
De moleculaire mechanismen dikke epitheelcel proliferatie en differentiatie slecht begrepen. Dit omvat hiaten in ons begrip van de cellulaire signalering omgeving van het stamcelcompartiment aan de onderkant van de colon epitheliale crypten. Er is ook een toenemende belangstelling voor de processen die enterocyt differentiatie ten grondslag liggen. Bijvoorbeeld, beter begrip van in vivo differentiatie nodig is als een benchmark voor studies gericht op de productie van in vitro primaire intestinale systemen 16.
De bovenstaande procedure bevat een aantal stappen die extra aandacht nodig hebben. Ten eerste, het verwijderen van de randen rond het bevroren weefsel segment (zoals besproken in paragraaf 3.2) is vereist als het weefsel randen krullen tijdens dissectie en invriezen. Het niet deze randen resultaat bewegen een gemengde populatie van oppervlakte- en crypte base cellen. Montage van het weefsel op een pre-gekoelde, genivelleerd oktober blok is ook essentieel. TZijn protocol kan naar andere delen van het distale colon worden aangepast door het veranderen van het aantal secties in elke pool. Bijvoorbeeld, zoals getoond in figuur 1B, mucosale crypte lengte varieert tussen 150-300 pm. Daarom, bij het bestuderen van het gebied tussen 4 cm-6 cm van de anus, het aantal onderdelen moet worden verhoogd van 15 tot 30. Belangrijk is dat dit protocol niet aanbevolen aan het proximale colon (7 cm-9 cm) als gevolg van vouwen ( plicae obliquae) die zich uitstrekken in het lumen waardoor het onmogelijk aparte ondergrond en crypte-base cellen door seriële snijden.
Seriële coupes technieken gebruikt om crypt-base bestuderen en oppervlakte epitheliale celpopulaties bij de mens. Echter, ons protocol voegt extra stappen die vereist zijn vanwege de kleine omvang van murine weefsel. Wij stellen voor dat de bovenstaande protocol zal zorgen voor het onderzoek van de crypte-base en oppervlak epitheliale cel populatie in genetisch handelbaar muis systemen. Inderdaad, samengevoegd secties Yield hoogwaardige eiwitten en RNA geschikte downstream-analyse. Toekomstige toepassingen kan de studie van de cel signaalroutes of chromatine immunoprecipitatie bevatten. Er moet echter worden opgemerkt dat, evenals een aantal van de alternatieve werkwijzen die hierboven zijn beschreven, het resulterende hoofdstukken wordt een mengsel van epitheel- en interstitiële lamina propria cellen. Concluderend, de hier beschreven protocol verschaft een snelle, hoge opbrengst voor de analyse van moleculaire processen in ruimtelijk afzonderlijke gebieden van het murine colon mucosa.
The authors have nothing to disclose.
Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn’s and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.
Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
Materials | |||
OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
Rneasy | Qiagen | 74104 | |
DNAse | Qiagen | 79254 | |
Reagents | |||
Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
PCR Primers | |||
primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |