Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.
The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.
Colonic epitelbelegg er en svært regenerativ vev, med bosatt stamceller påfyll av vev hver dagene en. Denne prosessen med regenerering krever opprettholdelse av en proliferativ stamcellelinjen. Over tid vil de nylig produserte dattercellene mister sin proliferative potensial og migrere mot den luminale overflate av tarmen. Sammenfallende med migrasjon, stamceller differensieres til modne barrieredannende enterocytter eller slimete produserer slimceller. Svikt i denne differensiering programmet er antatt å bidra til nedsatt epitele barrieren som er observert i inflammatorisk tarmsykdom og kreft i tykktarmen 2,3.
Detaljert studie av de ovennevnte prosessene vil kreve metoder for å isolere krypten-base og overflatecellepopulasjoner. Flere metoder eksisterer, hver med unike fordeler og ulemper. Aktuelle fremgangsmåter for isolering av intestinale epitelceller omfatter chelating midler og mekanisk dissosiasjon, noe som resulterer i isolering av hele krypter, epiteliale ark, eller enkle celler, avhengig av eksperimentelle betingelser 4,5. Dette er høyrente metoder, men endringer i intersignale har blitt rapportert under disse forholdene som kanskje ikke representerer det opprinnelige miljø 6,7. Laser fange microdissection tillater innsamling av romlig distinkt materiale, men oppnår lav molekyl utbytte 8,9. I menneskelig kolonvev, har serie horisontale cryosectioning utviklet metoder 10. Men murine slimhinnevevene er uoverkommelig liten for direkte anvendelse av denne teknikken. Hos mennesker intestinal krypten lengder (den fjernt mellom krypten-basen og overflateceller) i tykktarmen varierer mellom ~ 100-1.000 mikrometer 11. I mus, krypten lengder er mellom ~ 50-300 mikrometer (se figur 1A). Den lille størrelsen på muse krypter presenterer en utfordring til isolasjon av disse to cellepopulasjoner ved å bruke eksisterende protokoller.
Vi beskriver nå en lav kostnad, høyt utbytte metode for isolering av krypten-base og overflaten epitelial cellepopulasjonen i murine tarmvev. Tissue høstet på denne måten kan deretter bli analysert ved en rekke standard nedstrøms applikasjoner, inkludert immunfluorescens farging, RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction), eller Western blotting.
De molekylære mekanismene som er involvert i colonic epithelial celleproliferasjon og differensiering er dårlig forstått. Dette omfatter hull i vår forståelse av den cellulære signale miljø av stamcellelinjen i bunnen av colonic epithelial krypter. Det er også en økende interesse for de prosessene som ligger til grunn enterocyte differensiering. For eksempel økt forståelse for in vivo differensiering er nødvendig som en målestokk for studier som tar sikte på å produsere in vitro primære tarmsystem 16.
Prosedyren ovenfor inneholder flere trinn som krever ekstra oppmerksomhet. For det første, fjerne kantene rundt det frosne vev segmentet (som omtalt i kapittel 3.2) er nødvendig som vevet kanter curl under disseksjon og frysing. Unnlatelse av å flytte disse kanter resultatene er en blandet befolkning av overflate og krypten basis celler. Montering av vev på en pre-kjølt, flatet oktober blokken er også avgjørende. Tsin protokollen kan tilpasses til andre deler av den distale colon ved å endre antallet av seksjoner i hver blanding. For eksempel, som vist i figur 1B, varierer mucosal krypt lengde mellom 150-300 um. Derfor, når man vil studere området mellom 4 cm-6 cm fra anus, antall seksjoner bør økes fra 15 til 30. Det blir fore denne protokollen ikke foreslått for den proksimale kolon (7 cm-9 cm) på grunn av folder ( plicae obliquae) som strekker seg inn i lumen gjør det umulig å skille overflate og krypten baserte celler ved serie snitting.
Serielle snitt teknikker har blitt brukt til å studere krypten-basen og overflate epiteliale cellepopulasjoner i mennesker. Men legger vår protokoll ytterligere skritt som er nødvendige på grunn av den lille størrelsen på murine vev. Vi foreslår at ovennevnte protokoll vil tillate for undersøkelse av krypten-base og overflate epitelial cellepopulasjonen i genetisk medgjørlig musesystemer. Faktisk sammenslåtte seksjoner yield protein av høy kvalitet og RNA egnet nedstrøms analyse. Fremtidige applikasjoner kan omfatte studier av cellesignalveier eller kromatin immunoprecipitation. Imidlertid bør det bemerkes at, som flere av de alternative metoder som er beskrevet ovenfor, de resulterende seksjoner inneholder en blanding av epithelial og interstitielle lamina propria celler. Konklusjonen er at den protokoll som er beskrevet her tilveiebringer en hurtig, høy avkastning metode for analyse av molekylære prosesser i romlig adskilte regioner av murine kolon mukosa.
The authors have nothing to disclose.
Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn’s and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.
Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
Materials | |||
OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
Rneasy | Qiagen | 74104 | |
DNAse | Qiagen | 79254 | |
Reagents | |||
Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
PCR Primers | |||
primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |