Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
Mentre le cellule gliali del cervello, astrociti hanno diversi ruoli funzionali nel sistema nervoso centrale. In presenza di stimoli nocivi, astrociti modificano le loro proprietà funzionali e strutturali, una condizione chiamata astrogliosis reattiva. Qui, un protocollo per la valutazione delle proprietà morfologiche di astrociti è presentato. Questo protocollo include quantificazione dei 12 parametri diversi cioè la superficie e il volume del tessuto coperto da una astrociti (territorio astrociti), l'intero astrociti compresi rami, corpo cellulare, e nucleo, così come la lunghezza totale e il numero di rami, l'intensità della fluorescenza immunoreattività di anticorpi utilizzati per il rilevamento astrociti, e la densità astrociti (numero / 1.000 micron 2). A questo scopo tridimensionali (3D) immagini microscopiche confocale sono stati creati, e immagini 3D software di analisi come Volocity 6.3 è stato utilizzato per le misurazioni. Tessuto cerebrale di ratto esposti a beta amiloide 1-40 </sub> (Ap 1-40), con o senza un intervento terapeutico è stato utilizzato per presentare il metodo. Questo protocollo può essere utilizzato anche per l'analisi morfometrica 3D di altre cellule da de vivo o in vitro condizioni.
Introduction
Nel sano il sistema nervoso centrale (SNC), astrociti svolgono un ruolo importante nella regolazione del flusso di sangue, metabolismo energetico, la funzione sinaptica e plasticità, e ionico extracellulare e neurotrasmettitore omeostasi 1-3. Inoltre, astrociti rispondono a stimoli diversi nocive e condizioni anomale, come traumi, infezioni, ischemia o neurodegenerazione con astrogliosi reattiva che è caratterizzata da ipertrofia, la proliferazione e rimodellamento funzionale degli astrociti 4,5.
Astrogliosis reattiva può progettare la risposta infiammatoria e processo di riparazione del tessuto e, quindi, può influenzare l'esito clinico di interventi terapeutici. Di conseguenza, gli astrociti hanno ricevuto attenzione da neuroscienziato nel corso degli ultimi decenni come potenziali bersagli per interventi terapeutici per una varietà di malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale.
Astrociti normalmente hanno una forma stellata con ben-drami efined che si diffondono in tutto il soma 6. In una condizione di malato nel cervello, rami astrociti diventare aggrovigliata e mostrano estremità gonfie 7, ad esempio in presenza di beta amiloide (Ap).
Questo articolo presenta un protocollo per l'analisi di immagini 3D di astrociti acquisite al microscopio confocale. Dodici diversi parametri quantitativi per ogni astrociti sono stati misurati: delle superfici e dei volumi del territorio astrociti (il tessuto coperto da un astrociti), intera cella (incluse le filiali), corpo cellulare, e nel nucleo; la lunghezza totale e il numero di sportelli; l'intensità di fluorescenza di anticorpi utilizzati per la rilevazione astrociti; e la densità degli astrociti (numero / 1.000 micron 2). A questo scopo, abbiamo usato sezioni di cervello di ratti esposti a intrahippocampal iniezione di Ap 1-40 con o senza trattamento genisteina come sostanza anti-infiammatoria. Il protocollo descritto può essere utilizzato per un morfometricaANALISI DELLA diversi tipi di cellule in vitro o in vivo in condizioni diverse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel protocollo corrente, abbiamo impiegato 3D morfometria confocale per valutare 12 parametri diversi che sono stati associati con astrociti morfologia. A questo scopo, tessuti ippocampali di ratto con Ap 1-40 – stati usati astrogliosis indotta, con o senza pretrattamento genisteina come agente anti-infiammatorio. Utilizzando le immagini 3D e software morfometriche, siamo stati in grado di mostrare l'effetto di genisteina sulla astrogliosi cioè morfologia degli astrociti.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
Referências
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