Utilisation de l'analyse confocale<em> Xenopus laevis</em> Chargé d'enquêter sur les modulateurs de Wnt et Shh morphogène Dégradés
Summary
Le manuscrit ici fournit un jeu simple de méthodes pour analyser la sécrétion et la diffusion de ligands marqués par fluorescence dans Xenopus. Ceci permet d'obtenir un contexte pour tester la capacité des autres protéines de modifier la distribution de ligand et en permettant des expériences qui peuvent donner un aperçu des mécanismes de régulation des gradients de morphogènes.
Abstract
Ce protocole décrit un procédé pour visualiser des ligands distribués à travers un champ de cellules. La facilité de l'expression de protéines exogènes, ainsi que la taille de leurs cellules dans des embryons précoces, faire Xenopus laevis un modèle utile pour visualiser des ligands GFP étiqueté. ARNm synthétiques sont efficacement convertis après l'injection dans des embryons de xénope à un stade précoce, et les injections peuvent être ciblés pour une seule cellule. Lorsqu'il est combiné avec un traceur de lignage comme membrane attaché DP, la cellule injectée (et ses descendants) qui sont la production de la protéine surexprimée peuvent facilement être suivies. Ce protocole décrit un procédé pour la production de fluorescence étiquetée Wnt et Shh ligands injecté à partir de l'ARNm. Les procédés impliquent la micro dissection des explants ectodermiques (caps animales) et l'analyse de la diffusion de ligand dans plusieurs échantillons. En utilisant l'imagerie confocale, informations sur la sécrétion ligand et la diffusion sur un champ de cellules peut être obtenue. Les analyses statistiques des images confocales fournissent des données quantitatives sur la forme de gradients de ligands. Ces méthodes peuvent être utiles aux chercheurs qui veulent tester les effets des facteurs qui peuvent réglementer la forme de gradients de morphogènes.
Introduction
Au cours du développement embryonnaire précoce, les cellules sont progressivement engagés à suivre lignées spécifiques de différenciation: cela signifie un groupe de totipotentes (ou pluripotentes) cellules deviennent progressivement limité à établir des populations de cellules progénitrices déterminées pour donner naissance à un type de cellule. Signalisation cellule-cellule est au cœur de la régulation de la spécification de la lignée cours du développement embryonnaire. La manipulation de ces signaux sera nécessaire pour diriger les cellules souches vers destins particuliers pour soutenir nouveaux traitements médicaux.
Un nombre relativement faible de voies de signalisation sont réitéré au cours du développement, y compris les voies répondant à la superfamille TGF (nodals et BMP) 1-2, FGF 3, Wnts 4, 5 et hérissons. Ces protéines sécrétées lient des récepteurs présents sur la membrane de la cellule pour activer la transduction du signal en modifiant ainsi l'expression du gène et / ou le comportement des cellules. La réglementation stricte du signe de la celluleAlling est essentiel pour la spécification de la lignée cellulaire et le développement normal. Alors que la diaphonie entre ces voies est importante pour déterminer le destin des cellules, un seul ligand peut se solliciter des réponses distinctes à différentes concentrations. Gradients de morphogènes ont été décrits il ya plus de 100 ans comme une théorie pour expliquer comment les différents types de cellules peuvent dériver d'un domaine de 6 cellules. Signalisation des molécules produites par un groupe de cellules peut se diffuser sur une certaine plage, la diminution de la concentration avec une plus grande distance de la source. Les cellules exposées au signal répondront à la concentration locale à leur position dans le domaine des cellules, avec des cellules à des positions distinctes répondant différemment à différents niveaux du signal. Preuve de l'existence de morphogènes proviennent d'études sur l'embryon précoce Drosophila 7 et le disque de l'aile 8, ainsi que la branche des vertébrés 9 et 10 tube neural.
Les méthodes sont nécessaires pour envestigate comment gradients morphogène sont établis et d'identifier d'autres molécules importantes dans la régulation de ces gradients. Élégantes immunohistochimie en utilisant des expériences de visualiser in vivo des protéines endogènes dans le contexte de différents contextes génétiques ont été utilisées pour étudier les gradients de morphogènes 11-12. Toutefois, les bons anticorps et des mutants spécifiques ne sont pas toujours disponibles, de sorte que nous décrivons ici un protocole utilisant la surexpression de ligands fluorescents dans Xenopus, de fournir une alternative, méthode simple pour disséquer la façon dont les produits de gènes exogènes peuvent influencer la distribution de ligands à travers un champ de cellules. Xenopus laevis fournit un excellent système pour entreprendre ces types d'expériences que leurs embryons se développent à l'extérieur afin qu'ils soient accessibles dès les premiers stades. Leur grande taille (1-1.5mm de diamètre) simplifie la micro-injection et la manipulation chirurgicale et par étapes, la blastula cellules sont faciles à l'image car ils sont encore relativement grande (environ 2081; m de diamètre). Études de surexpression dans Xenopus sont simples à faire: ARNm injectés dans l'embryon précoce peuvent être ciblés vers des cellules particulières et est efficacement traduits.
Les constructions Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP fluorescence marqués ont été générés en utilisant pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 et eGFP. Le peptide HA est important de comprendre, non seulement pour fournir une étiquette supplémentaire moléculaire, mais aussi parce que l'on pense à agir comme une entretoise qui sépare les protéines Wnt et eGFP permettant à la fois des produits de gènes de fonctionner. Le produit d'assemblage utilisé pour la visualisation de Shh a été précédemment utilisée pour générer une souris transgénique exprimant une protéine de fusion eGFP Shh-15; cela a été aimablement fourni par Andy McMahon. Fait important, l'étiquette de GFP pour toutes les constructions est clonée en 3 'de la séquence de signal de telle sorte qu'il est retenu après le traitement. Il est également essentiel de veiller à ce que la protéine finale comprend des séquences nécessaires à la modification, par exemple supplén des lipides comme est le cas pour Shh et Wnt ligands ADNc ont été sous-cloné dans le vecteur d'expression pCS2 + qui est optimisé pour la prodution de l'ARNm synthétique; il comprend un promoteur SP6 et le signal de polyadénylation (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
Le travail décrit ici fournit un protocole simple pour comparer la sécrétion et la diffusion de fluorescence étiqueté Wnt et Shh marqués ligands. En injectant des quantités définies de l'ARNm synthétique, le protocole fait le tour des problèmes associés à l'expression variable à partir de différents vecteurs utilisant différents promoteurs. Ces méthodes ont été récemment appliqué pour étudier les effets du sulfate d'héparane endosulfatase Sulf1 sur Shh-eGFP et Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP la sécrétion et la diffusion chez Xenopus 16-17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une partie essentielle de ce protocole est de générer des ligands biologiquement actifs qui sont normalement traitées, sécrétés, et capables de déclencher une réponse dans la cellule réceptrice, en dépit d'un fragment fluorescent attachée. Il est essentiel d'établir que le produit du gène étiquetées par fluorescence est biologiquement active avec un essai approprié. Pour Shh-GFP, la capacité d'activer l'expression de PTC1 16 a été confirmée. Wnt8a a une capacité r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par un BBSRC accorder aux MdPE (BB / H010297 / 1), un quota de stagiaire de BBSRC SAR, et une bourse d'études de la MRC au format SWF.
Materials
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | N/A | N/A | Free download http://fiji.sc/Fiji |
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | N/A | http://www.photoshop.com/products |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer – M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | N/A | N/A | homemade |
| Zen lite software | Carl Zeiss | N/A | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
Referências
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. . FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Biologia do Desenvolvimento. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Biologia do Desenvolvimento. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics : A biologist’s guide. , (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).
