O manuscrito aqui fornece um simples conjunto de métodos que permitam analisar a secreção e difusão de ligantes marcados fluorescentes em Xenopus. Isto proporciona um contexto para testar a capacidade de outras proteínas para modificar a distribuição de ligando e permitindo experiências que podem dar uma visão sobre os mecanismos que regulam a gradientes de morfogénio.
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Artigo de método
Utilizando Análise de confocal
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve um método para visualizar ligandos distribuídos através de um campo de células. A facilidade de expressão de proteínas exógenas, juntamente com o grande tamanho das suas células em embriões precoces, Xenopus laevis fazer um modelo útil para a visualização de ligandos GFP. MRNAs sintéticos são traduzidos eficientemente após a injecção em embriões de Xenopus fase inicial, e as injecções podem ser destinados a uma única célula. Quando combinado com um marcador de linhagem, tais como membrana tethered RFP, a célula injectada (e seus descendentes) que estão a produzir a proteína sobre-expressa pode ser facilmente seguido. Este protocolo descreve um método para a produção de fluorescente etiquetado Wnt e Shh ligandos a partir de ARNm injectado. Os métodos envolvem a miCro dissecção de explantes ectodérmicos (CAPS animais) e a análise de difusão de ligando em amostras múltiplas. Utilizando imagiologia confocal, as informações sobre a secreção de ligando e de difusão sobre um campo de células pode ser obtida. As análises estatísticas de imagens confocal fornecer dados quantitativos sobre a forma de gradientes ligando. Estes métodos podem ser úteis para pesquisadores que queiram testar os efeitos dos fatores que podem regular a forma de gradientes de morfogénio.
Introdução
Durante o desenvolvimento embrionário inicial, as células são progressivamente comprometida a seguir linhagens específicas de diferenciação: isto significa um grupo de totipotente (ou pluripotentes) as células tornam-se progressivamente limitado ao estabelecimento de populações de células progenitoras determinados para dar origem a um tipo de célula. Sinalização célula-célula é central para a regulação da especificação das linhagens durante o desenvolvimento embrionário. A manipulação destes sinais serão necessários para dirigir células estaminais em relação a determinados destinos para suportar novos tratamentos médicos.
Um número relati....
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Protocolo
Ética declaração: Experimentos em animais foram realizados sob uma licença do escritório UK Home ao eurodeputado e os experimentos realizados foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de York, em conformidade com o CHEGADA (Animal Research: Relatório de experimentos in vivo) orientações. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).
1. Estratégia para gerar fluorescente etiquetado Ligands
Abaixo está um exemplo de protocolo para subclonagem Wnt8a-HA e eGFP em pCS2, a fim de produzir a construção de fusão no quadro Wnta-HA-EGFP:
- Criar e gerir reacções de PCR para Wnt8a-HA e eGFP. Uti....
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Resultados
Análise confocal de explantes cap animais expressando proteínas por fluorescência com a tag fornece um sistema eficaz para a visualização de distribuição ligando em diferentes condições experimentais. Num exemplo, a distribuição de GFP com etiquetas Shh é mostrado (Figura 1). Na fase de 2 células, embriões de Xenopus são injectados no ambas as células quer com um mRNA com controlo ou com o ARNm que codifica para Sulf1, uma enzima que modifica o sulfato de heparano na superfície celular e influe.......
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Discussão
Uma parte essencial do presente protocolo é a geração de ligandos biologicamente activos que são normalmente processados, segregadas, e capazes de eliciar uma resposta na célula receptora, apesar de ter uma porção fluorescente ligada. É crítico para estabelecer que o produto do gene marcado fluorescentemente é biologicamente activo utilizando um ensaio apropriado. Para Shh-GFP, a capacidade de activar a expressão de PTC1 16 foi confirmada. Wnt8a tem uma capacidade extremamente potente para induzir um.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma BBSRC conceder ao eurodeputado (BB / H010297 / 1), um BBSRC quota studentship a SAR, e uma bolsa de estudo MRC para SWF.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Acetato de amônio | Ambion | De Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonato | VWR International | RC-091 | |
| Nitrato de cálcio | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5'))Applied | Biosystems | AM 8050 | |
| Clorofórmio | Sigma | C 2432 | |
| Cloridrato de L-cisteína monohidratado | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Etanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | Download gratuito http://fiji.sc/Fiji | ||
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Ácido acético glacial | Fisher Scientific | A / 0400 / PB17 | |
| Lamínulas de vidro, No.1.5 | Suprimentos de Laboratório Científico | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Extrator de agulhas de vidro | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Agulhas de tração de vidro | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Gonadotrofina crônica humana (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Cloreto de lítio (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 e Software Zen (2008-2010) | Software Carl Zeiss | ||
| Matlab | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Água de grau molecular | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Botas | Código de barras 3600530 373048 | ||
| Espectrofotômetro | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Placa de Petri (55 mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Fenol-clorofórmio | Sigma | P3803 | |
| Software Photoshop | Adobe | http://www.photoshop.com/products | |
| DNA polimerase de alta fidelidade e buffers | Biolabs | M0530S Tampão - M0531S | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| Fita de isolamento de PVC | Onecall | SH5006MPK | |
| Kit de extração de gel | Qiagen | S28704 | |
| Enzimas de restrição tampões | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| DNAse livre de RNAse | Promega | ME10A | |
| Lâminas de borda única traseira de aço | Personna | 66-0403-0000 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 kit de transcrição | Ambion | AM1330 | |
| Lâminas de vidro | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| tungstênio | caseiro | ||
| Zen lite software | Carl Zeiss | Download grátis http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
Referências
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem.
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Reimpressões e permissões
