Använda Konfokal Analys av<em> Xenopus laevis</em> Att undersöka modulatorer av Wnt och Shh Morfogen övertoningar
Summary
Manuskriptet här ger en enkel uppsättning av metoder för att analysera sekretion och spridning av fluorescerande taggade ligander i Xenopus. Detta ger ett sammanhang för att testa förmågan hos andra proteiner för att modifiera ligand distribution och tillåta experiment som kan ge insikt i mekanismer som reglerar morfogen gradienter.
Abstract
Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera ligander fördelade över ett fält av celler. Den lätthet att uttrycka exogena proteiner, tillsammans med den stora storleken hos deras celler i tidiga embryon, gör Xenopus laevis en användbar modell för att visualisera GFP-märkta ligander. Syntetiska mRNA effektivt översätts efter injektion i tidig skede Xenopus embryon, och injektioner kan riktas till en enda cell. I kombination med en härstamning spårämne såsom membran bundna RFP, kan den injicerade cellen (och dess ättlingar) som producerar det överuttryckta proteinet lätt följas. Detta protokoll beskriver ett förfarande för framställning av fluorescerande taggade Wnt och Shh-ligander från injicerade mRNA. Metoderna involverar micro dissektion av ektodermal explants (skalltak) och analys av ligand diffusion i flera prover. Genom att använda konfokal avbildning, kan information om ligand sekretion och diffusion över ett fält av celler erhållas. Statistiska analyser av konfokala bilder ger kvantitativa data om formen av ligand gradienter. Dessa metoder kan vara till nytta för forskare som vill testa effekterna av faktorer som kan reglera formen av morfogen gradienter.
Introduction
Under tidig fosterutveckling, celler successivt åtagit sig att följa vissa linjer av differentiering: det innebär en grupp av totipotenta (eller pluripotenta) celler blir successivt begränsat till upprättandet populationer av stamceller fast beslutna att ge upphov till en celltyp. Cell-cellsignalering är av central betydelse för regleringen av härstamning specifikation under fosterutvecklingen. Manipulering av dessa signaler kommer att krävas för att rikta stamceller mot särskilda öden för att stödja nya medicinska behandlingar.
Ett relativt litet antal signalvägar som upprepade under utveckling, bland annat vägar svarar mot TGF familjen (nodals och BMP) 1-2, FGF 3, Wnts 4, och Igelkottar 5. Dessa utsöndrade proteiner binder receptorer närvarande på cellmembranet för att aktivera signaltransduktion därigenom ändra genexpression och / eller cellbeteende. Den snäva reglering av cell teckenAlling är väsentlig för cellhärstamning specifikation och normal utveckling. Medan överhörning mellan dessa vägar är viktiga för att bestämma cell öde, kan en enda ligand sig framkalla distinkta svar på olika koncentrationer. Morfogen gradienter beskrevs mer än 100 år sedan som en teori för att förklara hur olika celltyper kan härröra från ett fält av celler 6. Signalerings molekyler som produceras av en grupp av celler kan diffundera över ett visst intervall, minskar i koncentration med ett större avstånd från källan. Celler som utsätts för signalen kommer att svara på den lokala koncentrationen på sin position inom celler, med celler vid distinkta lägen svarar olika på olika nivåer av signalen. Bevis för existensen av morfogener kommer från studier av det tidiga Drosophila embryo 7 och vingen skivan 8, samt ryggradsdjuret lemmen 9 och neuralröret 10.
Metoder behövs för att itesta själva hur morfogen gradienter är etablerade och att identifiera andra molekyler som är viktiga för att reglera dessa gradienter. Eleganta experiment med användning av immunohistokemi att visualisera endogena proteiner in vivo i samband med olika genetisk bakgrund har använts för att undersöka morfogen gradienter 11-12. Men bra antikroppar och specifika mutanter är inte alltid tillgängliga, så vi beskriver här ett protokoll med användning av överexpression av fluorescerande ligander i Xenopus, att tillhandahålla ett alternativt, enkelt förfarande för att dissekera hur exogena genprodukter kan påverka fördelningen av ligander över ett fält av celler. Xenopus laevis ger ett utmärkt system för att utföra dessa typer av experiment som deras embryon utvecklas externt så att de finns tillgängliga på de tidigaste stadierna. Deras stora storlek (1-1.5mm i diameter) förenklar mikroinjektion och kirurgisk manipulation och genom blastula stegen cellerna är lätta att bilden som de fortfarande är förhållandevis stora (ca 2081; M över). Överuttryck studier i Xenopus är enkla att göra: mRNA injiceras i det tidiga embryot kan riktas till särskilda celler och effektivt översätts.
De fluorescerande taggade Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP konstruktioner genererades med hjälp av pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 och EGFP. HA-peptiden är viktigt att inkludera, inte bara för att ge en ytterligare molekylär tag, men också eftersom det är tänkt att fungera som en distans separera Wnt och EGFP proteiner som gör det möjligt både genprodukter att fungera. Konstruktet används för visualisering av Shh användes tidigare för att generera en transgen mus som uttrycker en Shh-EGFP-fusionsprotein 15; detta tillhandahölls vänligen av Andy McMahon. Viktigt är GFP tagg för alla konstruktionerna klonade 3 'till signalsekvensen så att den hålls kvar efter bearbetning. Det är också viktigt att se till att den slutliga protein innehåller sekvenser som krävs för ändringar, till exempel den Addition av lipider som är fallet för Shh och Wnt ligands.The cDNA subklonades in i pCS2 + expressionsvektor som är optimerad för produktionsdjur av syntetisk mRNA; det innehåller en SP6-promotorn och polyadenyleringssignalen (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
Det arbete som beskrivs här ger ett enkelt protokoll för att jämföra sekretion och spridning av fluorescerande taggade Wnt och Shh taggade ligander. Genom att injicera definierade mängder av syntetisk mRNA, circumnavigates protokoll eventuella problem i samband med variabel expression från olika vektorer med användning av olika promotorer. Dessa metoder har nyligen använts för att undersöka effekterna av heparansulfat endosulfatase Sulf1 på Shh-EGFP och Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP sekretion och diffusion i Xenopus 16-17.
Protocol
Representative Results
Discussion
En väsentlig del av detta protokoll genererar biologiskt aktiva ligander som normalt behandlas, utsöndras, och som kan framkalla ett svar i den mottagande cellen, trots att de har en fluorescerande bunden. Det är kritiskt att fastställa att den fluorescensmärkta genprodukten är biologiskt aktiv med användning av en lämplig analys. För Shh-GFP, var förmågan att aktivera uttrycket av PTC1 bekräftas 16. Wnt8a har en anmärkningsvärt potent förmåga att inducera en sekundär axel när den u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av en BBSRC bevilja ledamot av Europaparlamentet (BB / H010297 / 1), en BBSRC kvot anställning till SAR och en MRC STUDENT till SWF.
Materials
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | N/A | N/A | Free download http://fiji.sc/Fiji |
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | N/A | http://www.photoshop.com/products |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer – M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | N/A | N/A | homemade |
| Zen lite software | Carl Zeiss | N/A | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
Referências
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. . FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Biologia do Desenvolvimento. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Biologia do Desenvolvimento. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics : A biologist’s guide. , (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).
