Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
Macromoleculaire levering strategieën gebruiken meestal de endocytische route als een route van cellulaire binnenkomst. Echter, endosomale entrapment ernstig beperkt de efficiëntie waarmee macromoleculen dringen de cytosolische ruimte van de cellen. Onlangs hebben we dit probleem omzeild door het identificeren van het reagens dfTAT een disulfidebinding dimeer van het peptide TAT gemerkt met de fluorofoor tetramethylrhodamine. We hebben een fluorescent gemerkt dimeer van de prototypische celpenetrerende peptide (CPP) TAT, dfTAT die levende cellen doordringt en de cytosolische ruimte van cellen met een bijzonder hoog rendement bereikt gegenereerd. Cytosolische levering van dfTAT wordt bereikt in meerdere cellijnen, met inbegrip van primaire cellen. Bovendien is de levering niet merkbaar beïnvloeden levensvatbaarheid van de cellen, proliferatie of genexpressie. dfTAT kan leveren kleine moleculen, peptiden, antilichamen, biologisch actieve enzymen en een transcriptiefactor. In dit rapport beschrijven we de betrokken DFTA protocollenT synthese en cellulaire levering. Het manuscript beschrijft hoe de hoeveelheid eiwit afgegeven aan de cytosolische ruimte van de cellen te regelen door het variëren van de hoeveelheid eiwit extracellulair toegediend. Tenslotte, de karakteristieken van deze nieuwe technologie en stappen die betrokken zijn bij het valideren aflevering besproken. De beschreven protocols zou zeer nuttig zijn voor cel-gebaseerde testen en voor de ex vivo manipulatie en herprogrammering van cellen.
Introduction
De afgifte van proteïnen, peptiden of cel-doorlaatbare kleine moleculen in levende cellen vaak gewenst in veel biologische of biotechnologische toepassingen (cellulaire beeldvorming, functionele testen, cellulaire herprogrammering, enz.) 1-4. Vele benaderingen levering reeds gemeld, waaronder micro-injectie, elektroporatie, of het gebruik van carrier middelen (bv., Celpenetrerende peptiden zoals TAT, lipiden) 5-7. Elke techniek heeft meestal specifieke voor- en nadelen die deze benaderingen voldoende voor sommige toepassingen, maar niet voor anderen kunnen maken. Veelvoorkomende problemen impliceren slechte levering efficiëntie en / of gebrek aan controle over hoeveel materiaal wordt afgeleverd 8,9, toxiciteit of nadelige fysiologische gevolgen 10,11, gebrek aan temporele controle levering weinig cellen, maar niet in een gehele populatie (bijv., micro-injectie) 12, en de complexe chemische conjugatie of formulering regelingen 11.
<p 13. dfTAT is afgeleid van de bekende cel-penetrerende peptide (CPP) TAT. dfTAT bevat twee disulfide gebonden kopieën van TAT gemerkt met de fluorofoor tetramethylrhodamine. Ondanks hun gelijkenissen, TAT en dfTAT aanzienlijk verschillen in activiteit. TAT typisch geïnternaliseerd in cellen door endocytose. Dit CPP blijft echter meestal opgesloten in endosomen (dit meestal leiden tot een punctata verdeling van het peptide in de cellen wanneer onderzocht door fluorescentiemicroscopie). Zoals TAT wordt dfTAT efficiënt endocytose door cellen. Echter, dfTAT niet blijven zitten in endosomen. In plaats daarvan bemiddelt op een wijze die zeer efficiënt endosomale lekkage. De endosomolytisch activiteit van dfTAT kan vervolgens worden benut om macromoleculen te leveren door een simpele incubatie assay. ntent "> De huidige begrip van het leveringsproces is als volgt. dfTAT induceert macropinocytose. Hierdoor cellen geïncubeerd met dfTAT nemen oplosbare eiwitten, peptiden of kleine moleculen (moleculen plaats, MOI) aanwezig in media door vloeistoffase endocytose (zie figuur 1). Interacties tussen dfTAT en MOI niet nodig zolang beide entiteiten verkeer tezamen in de endocytische route. Als dfTAT een bepaalde drempel binnen het lumen van endocytische organellen bereikt, zijn endosomale lekkage activiteit (de moleculaire details uitdrukt blijven volledig gekarakteriseerde te zijn). De inhoud van het lumen van lekkende organellen, en dus de MOI, wordt dan losgelaten in de cellen. Deze benadering is daarom erg handig omdat geen conjugatie of formulering stelsels met MOI vereist. Omdat bovendien dfTAT is niet direct modificeren van een MOI moet ook niet storen MOI functie eenmaal intracellulaire afgifte wordt bereikt. Ook de concentratie vandfTAT gebruikt levering is onafhankelijk van die van de MOI in de media. Zo kan dfTAT concentratie constant tussen verschillende experimenten worden gehouden reproduceerbare efficiëntie in endosomale lekkage te garanderen. Daarentegen kunnen concentratie MOI in media geleidelijk worden veranderd om gewenste niveau bereiken van MOI geleverd cytosol.De hoge endosomale lekkage efficiency bereikt met dfTAT opmerkelijk onschadelijk zijn voor veel van de tot op heden geteste cellen. Dit is verrassend omdat endosomale organellen belangrijke component van de cellen en men zou verwachten dat de dramatische lekkage veroorzaakt door dfTAT gepaard zou gaan met schadelijke cellulaire responsen. Toch behandelde cellen woekeren in hetzelfde tempo als onbehandelde cellen en geen significante veranderingen in hun transcriptoomanalyse niet weergegeven. Bovendien kan de levering worden herhaald binnen enkele minuten met reproduceerbare levering efficiëntie, wat aangeeft dat de cellen kan ofwel tolereren of herstellen van het leveringsproces zonder verlieshun capaciteit voor endocytose of endosomale lekkage. Subtiele cellulaire reacties kunnen plaatsvinden tijdens dfTAT levering en de moleculaire details van wat deze reacties zou kunnen nog worden onderzocht. Maar door het combineren hoge efficiëntie, gemak protocollen, en gebrek aan toxiciteit, dient deze levering benadering blijken onmiddellijk bruikbaar in vele cel-gebaseerde applicaties. De hierin gepresenteerde protocollen zijn gericht op het maken van deze technologie toegankelijk voor de onderzoeksgemeenschap.
Protocol
Representative Results
Discussion
De cellen die voor dfTAT afgifte moet niet al confluent zijn (> 90% confluentie) omdat dit kan hebben op de levering efficiency. De cellen moeten ook gezond zijn: dode cellen in de cultuur kan apoptotische fragmenten waarmee dfTAT kan communiceren (bijvoorbeeld DNA van afgebroken kernen) vrij te geven. Hierdoor kan interfereren met de levering efficiëntie en de kwaliteit van de beeldvorming. De cellen moeten grondig worden gewassen om FBS te verwijderen voordat u dfTAT. BSA aanwezig in FBS kan binden aan df…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
Referências
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
