Abstract
Detektere små koncentrationer af molekyler ned til enkelt molekyle grænse har indflydelse på områder som tidlig påvisning af sygdommen, og de grundlæggende undersøgelser af opførslen af molekyler. Enkelt molekyle påvisningsteknikker almindeligvis udnytte mærker såsom fluorescerende tags eller kvantepunkter, men etiketterne er ikke altid tilgængelige, øger omkostningerne og kompleksiteten, og kan forstyrre de begivenheder, der undersøges. Optiske resonatorer er dukket op som et lovende middel til at påvise enkelte molekyler uden brug af etiketter. Øjeblikket er den mindste partikel detekteres af en ikke-plasmonically forbedret nøgne optiske resonator systemet i opløsning er en 25 nm polystyren kugle 1. Vi har udviklet en teknik kendt som Frequency Låsning Optical Whispering Evanescent Resonator (BLOMST), der kan overgå denne grænse og opnå etiket-fri enkelt molekyle detektion i vandig opløsning 2. Som signalstyrken skalaer med partikel volumen, vores arbejde repræsenterer en> 100x improvement i signal-støjforholdet (SNR) i løbet af den aktuelle stade til. Her procedurerne bag FLOWER præsenteres i et forsøg på at øge dens anvendelse i marken.
Introduction
Enkelt molekyle afsløring eksperimenter er nyttige til at reducere mængden af analyt anvendes i biosensorer, til tidlig opdagelse af sygdomme, og for at undersøge de grundlæggende egenskaber af molekyler 3. Sådanne eksperimenter udføres typisk ved anvendelse af etiketter, dog etiketter er ikke altid muligt at opnå for et bestemt protein, øger omkostningerne, kan forstyrre de begivenheder, der undersøges, og kan være ubelejligt, især til tidstro på stedet forsøg eller point-of- pleje diagnostik.
Den nuværende gyldne standard for etiketfrie biosensorer er overfladeplasmonresonans 4, men de kommercielle overfladeplasmonresonans systemer har typisk en typisk nedre detektionsgrænse på rækkefølgen af nM. For nylig har optiske resonatorer dukket op som en lovende teknologi til etiket-fri enkelt molekyle Biodetection 5. Optisk resonatorer arbejde baseret på de langsigtede (NS) indespærring af lys 6,7. Lys er udklingendekoblet ind i disse anordninger typisk via en optisk fiber. Når bølgelængden af det lys, der går gennem fiberen matcher resonans bølgelængden for resonator, lyser effektivt kobles til resonatoren. Dette kombineret lys helt internt reflekterer i resonator hulrum frembringe et kortvarigt felt i nærheden af omkredsen af resonatoren. Som partikler ind i flygtige felt og binder til resonator, resonans bølgelængden resonatorens ændringer i forhold til mængden af partiklen 8.
Med hensyn til påvisning kapacitet, har mikrosfæreformuleringer resonatorer tidligere blevet anvendt til at påvise enkelt influenza A-virus partikler (100 nm) 9,10. For nylig har plasmonically forbedret mikrokugle optiske resonatorer blevet anvendt til at påvise enkelt okseserumalbumin molekyler 11 og 8-mer oligonucleotider 12, men denne fremgangsmåde begrænser partiklen fangstområdet til 0,3 um 2 pr device. Større fangstområdet biosensorer er ideelle til at maksimere chancen for afsløring partikel. Nuværende løsning-baserede label-fri biosensorer teknologier med store (> 100 um 2) capture områder er blevet begrænset til detektering polystyrenpartikler ≥ 25 nm.
Vi har udviklet en etiket-fri biosensorer baseret på optiske resonator teknologi kaldet Frequency Låsning Optical Whispering Evanescent Resonator (BLOMST) 13 (figur 1), der er i stand til tidsopløst påvisning af enkelte molekyler i opløsning. FLOWER bruger lang foton levetid microtoroid optiske resonatorer kombineret med frekvens låsning feedback-kontrol, afbalanceret afsløring og beregningsmæssige filtrering til at opdage små partikler ned til enkelte proteinmolekyler. Anvendelsen af frekvens låsning tillader systemet at spore altid skiftende resonans af microtoroid som partikler binder, uden behov for at feje eller scanne laserbølgelængden istore intervaller. Principperne for FLOWER kan anvendes til at forbedre sporingskapaciteten af andre teknikker, herunder plasmoniske ekstraudstyr. I det følgende er procedurerne for udførelse af FLOWER beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forsøgsopstilling og Prøveforberedelse
- Fabrikere microtoroids ved hjælp af litografi, ætsning, og smeltende procedure som beskrevet tidligere 6. Fabrikere microtoroids oven på en siliciumskive (chip), der typisk har en større diameter på 80-100 um og en mindre diameter på 2 um.
- Slap omtrent en meter single-mode optisk fiber (125 um beklædning, 4,3 um modusdiameter felt) fra dens fiberspole.
- I midten af den afviklede del af den optiske fiber, strimler et lille segment (2,5 cm) af polymerovertræk omkring den optiske fiber ved hjælp af wire strippere. Bemærk: Dette er den del af den optiske fiber, der vil blive anvendt til udklingende koble lys ind i microtoroid.
- Rengør strippet fiber med isopropanol alkohol og en fnugfri klud.
- Holde denne del af fiberen på plads ved hjælp af en fiber holder lavet af hæftemagneter.
- Tynd den afisolerede fiber til ~ 500 nm ved Melting og trække anvendelse af en hydrogen lommelygte og to stepmotorer bevæger sig i modsatte retninger ved 60 um / min. Anbring den optiske fiber i den øverste del af flammen, som bør være ~ 10 mm høj. Stoppe med at trække fiberen, når transmissionen gennem fiberen stopper svingende, hvilket kan overvåges enten visuelt (ved at se lys, der er spredt sideværts fra fiberen blink til og fra) eller ved at forbinde fiber til en fotodiode, der er fastgjort til et oscilloskop .
- Kløve den ene ende af den optiske fiber og sæt det i en ikke-byggemodnede fiber-adapter. Placere denne ende af fiberen ind i indgangen på fotomodtageren.
- Fiber par den anden ende af fiberen spole til laseren ved hjælp af en fiberoptisk kobler.
- Placer microtoroid chip på toppen af en prøveholder (rustfrit stål, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) under anvendelse af enten epoxy eller dobbeltsidet tape.
- Monter prøveholderen på toppen af en positionering fase, der består af en 3-akset nano-positionering (nanocube) fase (se udstyrsliste) på toppen af en 3-akse mikrometer. Udføre alle forsøg på en pneumatisk isoleret optisk bord for at minimere vibrationer.
- Grov position prøven chippen ved hjælp af 3-aksen mikrometer.
- Juster microtoroid-holdige chip parallelt med den optiske fiber ved hjælp af nano-positioner. Bemærk: Juster microtoroid inden for en afstand på en bølgelængde af input lys (~ 633 nm). Til visualisering af denne proces brug to imaging kolonner (rør med objektiv og kamera, se udstyrsliste) anbragt på toppen og på siden af chippen.
- Optimere polariseringen af laserlyset ledes gennem den optiske fiber ved hjælp af en in-line polariseringskontrolenhed (se udstyrsliste) med en knop for at justere polarisering. Bemærk: Optimal polarisering opnås, når den målte dip i transmissionen af den optiske fiber forekommer den smalleste. Overhold denne dukkert på et oscilloskop (se trin 2.2 for flere detaljer).
- Konstruereet prøvekammer ved epoxying et dækglas over prøven trin under anvendelse af et objektglas som afstandsstykke. Bemærk: En plexiglas inddækning dækker hele opsætningen kan være nyttige til minimering af luftstrømme. En lille åbning bør overlades til at tillade opløsningen at blive pumpet ind med slangen.
- Termisk ligevægt partikel suspensioner eller enkelt-molekyle vandige opløsninger til ≥ 1 time i en RT vandbad (~ 500 ml). Bemærk: Prøverne fortyndes til den ønskede koncentration i mikrocentrifugerør ved anvendelse af de tilhørende buffere er angivet fra producenten, f.eks PBS eller HEPES. Hvis der ikke registreres bindende begivenheder, øge saltkoncentrationen i pufferen.
- Vortex partikel opløsninger (1 ml) kortvarigt for ~ 2 sek.
- Injicer partikel opløsninger i prøvekammeret ved 1 ml / min under anvendelse af en 1 ml sprøjte pumpe.
- Efter at prøven kammer har fyldt, skal du slukke sprøjtepumpen.
- Vent 30 sek før registrering af data for at minimerevirkningerne af mekaniske vibrationer som følge af fluidstrømmen, der kan påvirke målingen.
Låsning 2. Frekvens
- Re-par toroiden til den optiske fiber ved at flytte prøveholderen med nanopositioner, fordi koblingen vil blive forstyrret på grund af indsprøjtning af væske.
- Find resonans bølgelængden af microtoroid ved at scanne den computerstyrede input laser gennem en række bølgelængder. Udføre dette trin ved at sende en trekantet bølgeform spændingssignal til et piezoelektrisk element i laser controller, der regulerer laserens bølgelængde. Udfør forsøg under anvendelse af synligt lys (635 nm ± 2,5 nm), da der er lav absorption af lys i vand ved denne bølgelængde.
- Mål lystransmission gennem den optiske fiber ved at sætte outputtet af den optiske fiber i en auto-balanceret fotomodtager. Sæt produktionen af fotomodtageren i et oscilloskop ved hjælp af et BNC-kabel. Overhold on oscilloskop, der ved resonans bølgelængden af microtoroid, transmission gennem den optiske fiber falder.
- Fastgør produktionen af fotomodtageren til de vigtigste input af frekvensen låse feedback-styreenhed (se udstyrsliste) via et kabel.
- Kør frekvens låsning feedback-controller i autolås tilstand ved hjælp af top-of-peak låsning med en dither frekvens på 2 kHz og en amplitude på bølgelængde oscillation af 19 fm. Empirisk indstille proportional-integral-afledte indstillinger i softwaren vinduet med Ziegler-Nichols tuning regler 14. Bemærk: Disse værdier skal kun indstilles en gang ved begyndelsen af alle forsøg.
- Auto-låse laserens bølgelængde til resonans bølgelængde microtoroid. Udfør dette trin efter påfyldning prøvekammeret. Bemærk: Hvis bølgelængden skift er for stor, så den feedback controller vil miste lås og automatisk skifte til scanning tilstand for at lokalisere resonans bølgelængden placering. Denne ockøtere til bølgelængde skifter større end cirka en linjebredde (mindst 600 fm til alle systemer undersøgte her).
- Registrere produktionen af feedback-styreenhed ved 20 kHz under anvendelse af en 24-bit datafangst kort. Eksportere data som en tekstfil via dataopsamling software.
3. Databehandling & Analyse
- Fouriertransformation data i Matlab.
- Lav passerer data ved hjælp af en "brick-wall" filter med en cutoff ved 1 kHz for at fjerne det pålagte dither frekvens på 2 kHz (se supplerende kode File Screenshot 1).
- Beregningsmæssigt notch filtrere data ved hjælp af et vindue størrelse 16 Hz. Bemærk: Dette gøres for at fjerne kendte støjkilder, i dette tilfælde 60 Hz elektroniske linje støj og dens harmoniske, samt 100 Hz (kommer fra laseren driver) og dens harmoniske (se Supplemental kodefil Screenshot 1).
- Invers Fourier-transformation dataene tilbage til tidsdomænet.
- Medianfilter data ved hjælp af et vinduestørrelse på 1.001 prøver (se supplerende kode File Screenshot 2).
- Find trinvise ændringer i resonans bølgelængde ved hjælp af trin-finding algoritme kerssemakers et al. 15.
- Generere histogrammer af amplituden af hver bindende trin.
- Beregn partikelstørrelse ved anvendelse af ligning. (1) (se diskussionen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Particle bindende begivenheder ses tydeligt som trinlignende ændringer i resonans bølgelængden for microtoroid over tid (figur 2A). Højderne af disse trin er vist som et histogram i figur 2B. Figurerne 2-4 viser repræsentative spor fra bindingen af exosomer (nanovesicles), 5 nm silicaperler og enkelt human interleukin-2-molekyler, henholdsvis. Den omstændighed, at step-lignende begivenheder skaleres med partikelstørrelse viser, at teknikken er blevet udført korrekt. Dette kan analyseres ved at generere et histogram over trinhøjder (figur 2B) og sammenligne den maksimale trinhøjde observeret teoretiske forudsigelser, som beskrevet nedenfor.
Figur 1. Blokdiagram over toroide sensorsystem. Lys fra en afstemmelig laser diode er opdelt w ed en del sendes gennem den optiske fiber, der kobler lys ind i toroid, og den anden del sendes direkte til den ene indgang på en auto-balanceret fotomodtager. Udgangen af den optiske fiber sendes ind i anden indgang af auto-afbalanceret fotomodtager. Udgangen af fotomodtageren sendes til feedback-styreenhed, som modulerer laserlyset at finde værdien af resonans bølgelængden af microtoroid. Som partikler binder til toroid, resonansfrekvensen skift. Forskellen mellem bølgelængden af laser og resonans bølgelængde microtoroid sendes til en proportional-integral-derivat controller, der gør det muligt for laser til at matche bølgelængde toroiden så hurtigt og problemfrit som muligt. Klik her for at se et større version af denne figur.
p_upload / 53180 / 53180fig2.jpg "/>
Figur 2. Resonance bølgelængde ændre sig over tid som 20 nm perler binder til overfladen af microtoroid. (A) Skift i resonans bølgelængde microtoroid over tid som 20 nm perler binder til overfladen. (B) Histogram af højderne (amplituder) af hver resonans bølgelængde trin begivenhed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Resonance bølgelængde ændrer sig over tid som individuelle exosomer binder til overfladen af microtoroid. Er individuelle bindende begivenheder ses som diskrete ændringer (trin) i resonans bølgelængde over tid."> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Resonance bølgelængde ændre sig over tid som 5 nm silicaperler binder til overfladen af microtoroid. Partikler klæbe til toroid overflade via passive adsorption. Partikel bindende begivenheder ses som diskrete trin i resonans bølgelængde toroiden over tid. Desorption af en partikel ses som en nedadgående skridt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Resonance bølgelængde ændre sig over tid som IL-2-molekyler binder til overfladen af microtoroid. Makromolekylære bindende begivenhederses som diskrete trin i resonans bølgelængde over tid. Disse trin ligner dem i figur 4 som de to typer af partikler er af nogenlunde samme størrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som en partikel binder, resonans bølgelængden (λ) toroidens stiger. Hvis en partikel unbinds, resonans bølgelængde tilsvarende aftager (en step-down begivenhed). Partikeldiameteren (d) kan bestemmes ved histogrammer af amplituden af hver bølgelængde trin. Højden af hver bølgelængde trin varierer på grund af størrelse variationer af den bundne partikel og på grund af placeringen på microtoroid hvor partiklen bindes. Den maksimale ændring i resonans bølgelængde (trinhøjde) opstår, når partikler binde ved ækvator af microtoroid hvor det elektriske felt (E 0, max) er maksimum. Denne maksimale trinhøjde (Δλ) er relateret til partikeldiameter gennem Eq. (1) 8, hvor a er partiklens radius, D er en dielektricitetskonstant baseret på brydningsindekset af det bundne partikel og dens omgivende medium, V m er den tilstand volumen light inden for microtoroid bestemmes ved finite element simuleringer 2, og E 0 (R s) er amplituden af det elektriske felt på partiklen ækvator også bestemt ved finite element simuleringer:
Inverterende Eq. (1) viser, at signalstyrken (Δλ) skalaer med partikel volumen (en 3). Vores dielektrisk faktor er defineret som:
hvor er brydningsindekset af de omgivende medier og er indekset brydning af partiklen. Teoretiske estimater for partikelstørrelse baseret på ligning (1) samt yderligere histogrammer og størrelse calningerne præsenteres i 2, 16.
FLOWER kan ændres for hurtigere sporing ved at øge frekvensen, ved hvilken frekvens låsning feedback-styreenhed spor bølgelængde microtoroid. Proceduren databehandlingen kan modificeres ved anvendelse af en glidende gennemsnit i stedet for et medianfilter, og bindende begivenheder kan stadig udvindes imidlertid medianfilteret forårsager smarte kanter til at være bedre bevaret. Begrænsninger i denne teknik nævnes, bølgelængden forskydning af microtoroid ved partikel binding afhænger af, hvor på resonator partiklen lander. Således bekræftelse af bindingen af en enkelt partikel er afhængig af dannelsen af et histogram over mange diskrete bindende begivenheder. Hvis der ikke registreres særskilte bindende begivenheder, øge saltkoncentrationen af opløsningsmidlet hjælper.
Betydningen af denne teknik med hensyn til de eksisterende metoder er, at ingen etiketter er forpligtet til at forespørge målmolekylet.Selektiv binding kræver imidlertid funktionalisering føleren med antistoffer. Andre fordele kan nævnes, at der siden microtoroid resonatorer har større capture områder sammenlignet med høj følsomhed overfladeplasmonresonans metoder, er mere tilbøjelige til at forekomme partikel bindende begivenheder. Hertil kommer, fordi FLOWER ikke kræver fluorescerende tags, der kan photobleach, FLOWER er i stand til lange (> 10 sek) målinger med hurtig (millisekund) tidsopløsning.
Kritiske skridt i protokollen omfatter tilpasse den optiske fiber konus med microtoroid. Når toroid er nedsænket i væske, for meget bevægelse af fiberen gennem væsken kan forårsage konus at bryde, og dermed slutter eksperimentet. Blomst i sin nuværende formulering er derfor uegnet til forsøg på tidsskalaen timer. Desuden når microtoroid er nedsænket i væske og partikler binder, kvalitetsfaktoren (Q) uigenkaldeligt falder over en tidsskala timer og peak locking i sidste ende kan blive ustabil. I denne situation kræves en ny enhed. Fordi vi rastersimulering vores laser frekvens i et meget lille område omkring resonans peak, er FLOWER ikke samtidigt scanne over hele resonans spektrum og derfor ikke måle ændringer i kvaliteten faktor i realtid som partikler binde. Ser man på kvalitet faktor før og efter bindingen af kun nogle få partikler, ser vi ikke signifikant Q-faktor nedbrydning. Vi forventer, at dette skyldes, at de oprindelige uberørte toroider har relativt lav Q-faktor (belastet Q i vand på ~ 1x10 5 -5x10 6).
Vi bemærker, at laser-induceret udsving støj trækkes ud ved hjælp af auto-afbalanceret fotomodtager. Vi minimere udsving i den optiske fiber mod toroid ved at placere fiberen i direkte kontakt microtoroid. Desuden, hvis PID parametre ikke er indstillet korrekt, vil udsving frem, dvs systemet vil ikke hurtigt og accuratEly spor bølgelængde skift. Ziegler-Nichols tuning regler kan bruges til korrekt indstillet PID indstillinger 14. Ved at følge procedurerne beskrevet her, bør det være muligt at detektere og størrelse nanopartikler spænder fra hundredvis af nanometer ned til nogle få nanometer, herunder enkelt biologiske molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable diode laser | Newport | TLB-6300 | |
| Laser controller | Newport | TLB-6300-LN | |
| Frequency locking feedback controller | Toptica Photonics | Digilock 110 | |
| Auto-balanced photoreceiver | Newport | Model 2007 | |
| In-line polarization controller | General Photonics | PLC-003-S-90 | |
| 24-bit data acquisition card | National Instruments | NI-PCI-4461 | |
| Recombinant human interleukin-2 | Pierce Biotechnology | R201520 | |
| 20 nm polystyrene beads | Thermo Scientific | 3020A | |
| NanoCube XYZ Piezo Stage | Physik Instrumente | P-611.3 | |
| Optical table | Newport | VH3660W-OPT | |
| Objective lens for imaging column | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| Imaging column (adaptor tube) | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| High-Res CCD camera for imaging column | Edmund Industrial Optics | NT39244 |
References
- Lu, T., et al. High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).
- Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators. Light: Science and Applications. , (2016).
- Knight, A. Single molecule biology. , Elsevier/Academic. (2009).
- Jonsson, U., et al. Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology. BioTechniques. 11, 620-627 (1991).
- Vollmer, F., Arnold, S. Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules. Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).
- Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip. Nature. 421, 925-928 (2003).
- Vahala, K. J.
- Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption. Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).
- Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).
- He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers. Nat Nano. 6, 428-432 (2011).
- Dantham, V. R., et al. Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity. Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).
- Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform. Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).
- Su, J. Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators. ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).
- Åström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems : an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2008).
- Kerssemakers, J. W., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442, 709-712 (2006).
- Su, T. -T. J. Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators. , California Institute of Technology. (2014).
