Translational Kanser Araştırma İnsan Doku ile Çalışma
Summary
Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.
Abstract
Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.
Introduction
Tıbbi araştırma, insan hücre hatları ve hayvan modellerinde hem çalışma son derece yararlanmıştır. Hücre çizgileri iyi bir sistem elemanlarının kontrolü, hem de uygun organizmadan hücrelerin kullanımı için izin verir. Hücre hatları yanıtları 1 etkileyebilecek diğer hücrelerin, stromal bileşenleri ve organların etkisini özetlemek değil, çünkü daha fazla temsilcisi olurken, sağlık ve hastalık sorumlu olabilir mekanizmalarının büyük ölçüde basitleştirilmiş anlık sunar, insan hücreleri ile çalışma. Öte yandan, hayvan modelleri, insan hastalığını ve genetik heterojenite üreyen tamamen doğru olmasa da, çoğu modelde 2,3 bütün hayvan sistemlerinin giriş için izin vererek daha fazla fikir sunar.
Eksiklikleri bir yana, her iki yöntemin de yararları var ve tamamlayıcı niteliktedir. Ancak, ana hedefi bir tam vücut, çoklu organ sisteminde insan hücreleri ve organları, çalışma devam etmektedir. Bu duruma göre, geleneksel araştırma tak sahipDaha iyi mekanizmaları altta yatan hastalığın kavramak için, insan organları ve hastaların çıkarılan dokuların çalışma kolaylaştırmada büyük adımlar tr. Translational araştırma ve böylece, tüm vücutta ve uygun hücrelerde tedavileri ve hastalıkların sonuçlarını okuyan hücre ve hayvan çalışmaları 4 arasında iki dünyanın en iyi sağlama avantajı sunuyor.
Translational araştırma kusurları olmadan da değil. Insan hastalardan hasat edilen örnekler, ana bilgisayardan uzaklaştırılması üzerine hemen iskemi ve başka bir şekilde korunacak olan, diğer dış faktörlerle tabi tutulur. Bu stres kaynaklı moleküler ve genetik değişikliklere neden olur ve daha sonraki çalışmalarda önyargı neden olabilir. Bu nedenle, çok çaba en aşağı çalışmalar için 5 organ ve hücre bütünlüğünü korumak için sıkı yöntemlerle dokuların çıkarılması ve işlenmesi girmiştir. Yöntemleri o seçerken önemlisi, gelecekteki uygulamalar yakından ele alınmalıdırf belli yöntemler hücresel bileşenleri için zararlı olabileceğinden, insan örnekleri işleme ve diğerleri tutumlu sırasında sinyal yolları.
İnsan dokuları içeren herhangi araştırma, düzenleyici konular ele alınmalıdır. Tuskegee ve Belmont raporlar sonrasında, biyomedikal araştırma doğasında riskler genellikle kaçınılmaz etik ikilemler 6 sonuçlanan ile ilişkili olduğu gerçeğini büyüyen bir kabul vardı. Ulusal standartlara ihtiyaç tanındı ve federal hükümet Belmont Raporu ilkelerine uyulması (kişiler, Yararlılık, Adalet için saygı) için bir araç olarak Kurumsal Gözden Kurulları (IRBs) oluşturuldu.
Herhangi bir kurumun IRB araştırma katılımcılarının korumakla yükümlüdür doktorlar, araştırmacılar ve topluluk üyeleri bir kuruldur. Gönüllü rıza biyomedikal araştırma çalışmalarının tüm katılımcıların elde gerektirir ve bu rıza bir aydınlatılmış onam fo belgelenmiş olması rm. Bilgilendirilmiş onam süreci bilinçli bir karar çalışmaya kayıt veya katılım devam edip etmemeye yapılabilir böylece, bir katılımcının yeterli bilgi vermeyi amaçlamaktadır. Bu bağlamda, bilgilendirilmiş onam belge iyi okunabilirliği olmalı ve kolayca hedef nüfusun (6 th 8 inci sınıf okuma seviyesi) anlayabileceği dilde yazılmış olmalıdır. Baskı veya uygunsuz etkiden olasılığı minimize edilmelidir, ve konu katılımını dikkate için yeterli zaman verilmelidir. Katılımcı da ceza olmadan çalışmanın seyri sırasında herhangi bir aşamada onayı geri alma hakkını kullanmasına izin verilmelidir. Gönüllü bilgilendirilmiş onam araştırma gönüllünün katılımı için zorunlu ön koşulu ve aynı zamanda 7 hukuken etkilidir.
Insan korunması için yönetmelik gereğince konular 21 CFR 50,25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), çalışmaya katılanların araştırma amacı haberdar edilmelidir, araştırmaya katılan prosedürleri, katılım alternatifleri, topluma ve muhtemelen tek araştırma tüm öngörülebilir riskler ve rahatsızlıkları (sadece fiziksel yaralanma, aynı zamanda mümkün psikolojik, sosyal ya da ekonomik zarar, rahatsızlık ya da rahatsızlık dahil), faydaları, konu katılması bekleniyor zamanın uzunluğu, kişi katılım gönüllü olduğunu belirten açıklamada, soruların ya da araştırma ile ilgili yaralanma ya da acil durumlarda cevaplar için iletişim ve katılmak için bu reddin, düzenli klinik bakım bir uzlaşma olarak herhangi bir sonuç veya faydalar herhangi kaybına neden olmaz katılımcı aksi hakkı olduğunu gizlilik ve çekilme hakkına kişinin hakkına ilişkin nihayet bir açıklama onun / onu tanı sonucu almak veherhangi sonuçları olmadan herhangi bir zamanda çalışma. Çalışmanın süresince onayı geri katılımcılardan doku örnekleri banked edilmemelidir ve hemen tükenmiş olması gerekir. Aydınlatılmış onam bir ya da daha fazla eleman feragat pratik gerekli unsurlara veya gerekli unsurlar uygulanabilir olmadığında çalışmalar için bir değişiklik olmadan yapılamaz olabilir bazı araştırma projeleri için IRB elde edilebilir. Büyük bir dikkatle veri gizliliğini sağlamak için alınmalıdır. Sağlık Sigortası Taşınabilirlik ve Sorumluluk Yasası (HIPAA) kullanarak veya katılımcıların yazılı izni olmadan "Korumalı Sağlık Bilgileri" (PHI) ifşa engelleyen bir federal yasa olduğunu. PHI içerir, ancak sağlık bilgileri iletilen veya muhafaza herhangi bir biçimde ya da orta ve bireysel 9 tanımlamak için kullanılabilir alanları içerir ile sınırlı değildir.
Bu çalışma sayesinde, biz Tissu'nun sırasında uyulması gereken protokol anahat hedefliyoruze işleme – tedarik dahil, depolama ve doku çıkarma üzerine maruz streslere bağlı olarak meydana gelebilir önyargıları en aza indirecek şekilde bu katı yönergeleri izleyerek önemini vurgulamaktadır. Okuyucular Ne tahlil (ler) en iyi onların ihtiyaçlarına uygun nitelikli bir yargıya böylece biz de aşağı tahlillerde ya da bu tür örnekler üzerinde yapılabilecek analizler (Şekil 1) kısa bir özetini sunmak için gayret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sonuçta, işleme yöntemleri, istenen hipotez tarafından dikte ve (Şekil 1) yapılacak teknik testlerin tahmin edilmelidir. Aşağıdaki bölüm, doku kesitlerinde gerçekleştirilebilir potansiyel tahlilleri açıklamak için özet olarak hizmet vermektedir. Hiçbir ayrıntılı bir bakış anlamına gelir, ama teknikleri anlatan ve onların güçlü ve zayıf yönlerini listeleyerek kılavuz örnek işleme yöntemleri ve alt testlerin seçimi yardımcı olmak için tasarlanmıştır gereğidir. </p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, John G. ve Marie Stella Kenedy Memorial Vakfı (Hibe # 0727033) ve Melanom Araştırma İttifak hayırsever katkıları ile desteklenmiştir. Yazarlar Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, MD Anderson Kanser Merkezi Dairesi yanı sıra, doku dağıtımı, toplanması koordine ve translasyonel araştırma kolaylaştırmak için Texas MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal Doku Bankası (ITB) University of teşekkür etmek istiyorum Patoloji ve Melanom Ay Shot Programı. Son olarak, yazarlar melanom etkilenen tüm hastalara ve ailelerine teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
Referências
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , (2010).
- McCabe, P. M., et al. Animal models of disease. Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M., Gilbert, N. The ethics of social research. Researching social life. , 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. . IRB guidebook. , (1993).
- . . MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, (2009).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -. Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Bioquímica. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G. Protein microarrays and proteomics. Nat Genet. 32, 526-532 (2002).
