Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Summary

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Abstract

Experimentos para medir las propiedades de permeabilidad de microvasos perfundidos individualmente proporcionan un puente entre la investigación de los mecanismos moleculares y celulares que regulan la permeabilidad vascular en cultivos de monocapas de células endoteliales y las propiedades de intercambio funcionales de camas microvasculares enteros. Un método para canular y perfundir microvasos venulares de mesenterio de rata y medir la conductividad hidráulica de la pared de microvasos se describe. El equipo principal necesaria incluye un microscopio intravital con una etapa modificado grande que soporta micromanipuladores para posicionar tres Microtools diferentes: (1) una micropipeta de cristal biselado para canular y perfundir el microvasos; (2) un micro-oclusor de vidrio para bloquear transitoriamente la perfusión y permitir la medición de movimiento de circulación de agua transvascular a una presión hidrostática medido, y (3) una varilla de vidrio contundente para estabilizar el tejido mesentérico en el sitio de canulación. El Landis micro-oclusión techniq modificadoue utiliza glóbulos rojos suspendidos en el líquido de perfusión artificial como marcadores de movimiento de fluidos transvascular, y también permite mediciones repetidas de estos flujos condiciones experimentales se cambian y la diferencia de presión osmótica hidrostática y coloidal a través de los microvasos se controlan cuidadosamente. Las mediciones de la conductividad hidráulica primero utilizando un perfundido control, a continuación, después de volver a la canulación de la misma con los microvasos perfundidos de prueba permitir comparaciones de la respuesta de los microvasos bajo estas condiciones bien controladas emparejados. Los intentos de extender el método a los microvasos en el mesenterio de ratones con modificaciones genéticas esperados para modificar la permeabilidad vascular fueron severamente limitadas debido a la ausencia de largas microvasos rectas y no ramificados en el mesenterio ratón, pero la reciente disponibilidad de las ratas con modificaciones genéticas similares utilizando Se espera que la tecnología / Cas9 CRISPR para abrir nuevas áreas de investigación en que los métodos descritos en el presente documento pueden aplicarse. </p>

Introduction

Microperfusión en la vasculatura conlleva establecer el flujo de un líquido de perfusión artificial de composición conocida controla a través de una micropipeta en un vaso sanguíneo por lo general menos de 40 micras de diámetro. El recipiente de perfundido se mantiene dentro de su entorno de tejido normal y es perfundido con la sangre del animal hasta el momento de la canulación. Cuando se utiliza junto con una serie de imágenes de vídeo o técnicas fluorométricos, pt microperfusión situ permite la medición de los flujos de agua y de solutos a través de las paredes de los microvasos en condiciones donde se sabe que las fuerzas de conducción para estos flujos y las propiedades de permeabilidad de la pared vascular pueden ser directamente evaluado. Además, mediante el control de la composición del líquido que rodea al de los microvasos en el tejido (perfundido y superperfundido), la regulación de la permeabilidad microvascular y el intercambio se puede investigar al permitir que las células endoteliales que forman la pared de los microvasos de estar expuestos a una variedad de correocondiciones Xperimental (agonistas, condiciones de perfusión modificados, indicadores fluorescentes para medir la composición intracelular y la señalización) durante períodos medidos con precisión de tiempo (seg a hr). Además, las evaluaciones ultraestructurales o citoquímicos de estructuras moleculares celulares clave que regulan la barrera se pueden investigar en los mismos microvasos en el que se mide directamente la permeabilidad. El enfoque de esta manera forma un puente entre la investigación de los mecanismos celulares y moleculares para modificar la función de barrera endotelial en cultivos de monocapas de células endoteliales y la investigación en microvasos intactos. Ver las siguientes revisiones para evaluación adicional ^1-6.

Una limitación de microperfusión es que sólo se puede utilizar en lechos microvasculares que son delgadas, transparentes y tienen una integridad estructural suficiente para permitir la canulación con una micropipeta de vidrio. Mientras que las primeras investigaciones utilizan microvasos rana en el mesenterio y delgado cutánea angina de muscle ^7,8, con mucho, la preparación más comúnmente utilizado en los modelos de mamíferos es el mesenterio de rata ^9-15. La mayoría de las investigaciones se han centrado en los cambios agudos en la permeabilidad vascular estudiado durante períodos de 1-4 horas, pero las investigaciones más recientes se han extendido a las mediciones en los buques individuales de 24-72 hr después de una perfusión inicial ^12,16. La tecnología CRISPR recientemente desarrollado, que promete hacer modelos de ratas modificadas genéticamente más disponibles para el estudio de la regulación de la permeabilidad vascular ¹⁷ debería permitir a los métodos descritos en esta comunicación que se aplicarán en los microvasos venulares del mesenterio en estos importantes nuevos modelos de rata.

El método requiere un microscopio invertido equipado con una platina del microscopio a la medida lo suficientemente grande como para contener tanto la preparación de los animales y al menos tres micromanipuladores utilizado para microherramientas posición cerca de la embarcación perfundido y para alinear una micropipeta perfusión con el buquelumen. Por ejemplo, una plataforma personalizada para una platina del microscopio xy (alrededor de 90 × 60 cm) puede fabricarse a partir de una placa de acero 1 cm de espesor con un revestimiento a prueba de herrumbre. La etapa está unido a una tabla de índices de ingeniería o dos diapositivas en cola de milano montados en ángulos rectos y apoyadas sobre pilares de teflón o transferencias de bolas para el movimiento en el plano horizontal. Una plataforma típica (véase la figura 2) tiene mucho en común con el equipo de microscopio y microposicionamiento utilizado para una serie de experimentos microcirculación intravital como los que para medir el flujo único de los vasos sanguíneos y el hematocrito, el suministro de oxígeno local microvasos sanguíneos perfundidos, la regulación de liso vascular el tono muscular y la acumulación microvascular local de los trazadores fluorescentes inyectados en toda la circulación. ^18-26

El aspecto fundamental de la técnica es la medición del flujo de volumen _(v J) a través de un área de superficie definida (S) de la pared de los microvasos. Para llevar a caboesto a través de la técnica de Landis modificado descrito en el presente documento un sencillo microscopio invertido es adecuada. Una cámara de video pequeña está montado en el puerto de imagen y la señal de vídeo, con una base de tiempo de descuento, se visualiza en un monitor de video y grabado, ya sea en forma digital en un ordenador o como una señal digital o analógica en una grabadora de vídeo. Una vez que el microvasos se canula la porción de la microvasos visible a la cámara se puede cambiar moviendo el escenario y manipuladores como una unidad sin alterar la canulación.

Medición de los flujos de transvascular también se puede combinar con las investigaciones más detalladas utilizando un microscopio de fluorescencia sofisticado con filtros adecuados tales como equipos de perforación utilizados para las mediciones de permeabilidad soluto, monitoreo relación fluorescente de calcio citoplasmático u otros mecanismos celulares, y de formación de imágenes confocal ^{6,12,13, 27.} Una ventaja clave de todos los enfoques microperfusión es la capacidad de tomar medidas repetidas, en el mismo buque, En la variación controlada de fuerza motriz, como presiones hidrostáticas y oncóticos o cambio inducido en las respuestas de los buques a las condiciones inflamatorias. El diseño más común es una comparación emparejada de la conductividad hidráulica medida (L _p) en el mismo recipiente con el recipiente primero perfundido a través de una micropipeta llena de un líquido de perfusión de control y la suspensión de glóbulos rojos para establecer un estado permeabilidad línea de base, a continuación, con una segunda pipeta con el agente de prueba añadido al perfundido. Múltiples canulaciones son posibles con el ciclo se repite después de la reperfusión con la pipeta de control.

El presente protocolo demuestra la canulación y microperfusión de un vaso venular en mesenterio de rata para grabar flujos de agua a través de la pared de microvasos y medir la L _p de la pared del vaso, un índice útil de la permeabilidad de la vía común para el agua y solutos a través de la intacto barrera endotelial. El procedimiento se denomina techniq Landis modificadoue porque el principio Landis original de utilizar el movimiento relativo de los glóbulos rojos como una medida de intercambio de fluido transvascular después de la perfusión está bloqueado se conserva ^28, pero la gama de condiciones experimentales (por ejemplo, las diferencias de la presión oncótica hidrostáticas y de albúmina a través de la pared de los microvasos) disponible después microperfusión es mucho mayor que en la sangre perfundida microvasos uncannulated ^8,29.

Protocol

Declaración de Ética: Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional. 1. Fabricación preliminar de Micropipetas, inmovilización y bloqueadores Tire varios tubos capilares de vidrio de borosilicato limpias en un medio con un extractor electrónica ajustado de manera que, cuando se tira, la porción estirada del tubo es de aproximadamente 1 cm de longitud y las dos mitades son algo simétrica. Asegúrese de q…

Representative Results

La Figura 4 muestra los resultados de la medición de la evolución temporal de los cambios en L p en una rata venular microvasos canulado sucesivamente con cuatro perfundidos. 33 La magnitud de L p calculado a una presión constante se usó como una medida de los cambios en la permeabilidad de la pared de los microvasos, primero en el estado de control con un líquido de perfusión que contiene 1% de albúmina de suero bovino a continuación, cuando el recipiente se exp…

Discussion

Los detalles de los cálculos _PL. Aunque el movimiento del fluido transvascular ocurre mientras el buque está libremente perfundido, dicho intercambio es demasiado pequeña para ser medida durante la perfusión libre porque es típicamente menos de 0,01% de la tasa de perfusión buque. Sin embargo, cuando la perfusión se detiene transitoriamente mediante la oclusión de la microvasos, el flujo de transvascular (es decir, la filtración) se mide desde el movimiento de las células rojas de …

Materials

MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform–1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio–generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray–needs cord and controller–240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope–see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back–can be purchased from Amazon