Mikroperfusionskammarens Teknik för att undersöka Reglering av mikrokärls permeabilitet i Rat krös

Summary

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Abstract

Experiment för att mäta permeabilitetsegenskaper av individuellt perfuserade mikrokärl ger en brygga mellan utredning av molekylära och cellulära mekanismer som reglerar vaskulär permeabilitet i odlade endotelceller cellmonoskikt och funktionella valuta egenskaperna hos hela mikrovaskulära sängar. En metod för att cannulate och BEGJUTA venular mikrokärl av råtta tarmkäxet och mäta den hydrauliska konduktiviteten hos microvessel väggen beskrivs. De viktigaste utrustning som behövs innefattar en intravital mikroskop med en stor modifierad scen som stöder mikromanipulatorer att placera tre olika mikroverktyg: (1) en avfasad glasmikropipett att kanylera och BEGJUTA mikrokärls; (2) en glasmikro ockluderingsanordning att övergående blockera perfusion och möjliggöra mätning av transvaskulär vattenflöde rörelse vid en uppmätt hydrostatiskt tryck, och (3) en trubbig glasstav för att stabilisera den mesenteriala vävnaden vid stället för kanylering. Den modifierade Landis mikro-ocklusion technique använder röda blodkroppar suspenderade i den konstgjorda perfusatet som markörer för transvaskulär vätska rörelse, och även möjliggör upprepade mätningar av dessa flöden som experimentella betingelser förändras och hydrostatisk och kolloidosmotiskt tryckskillnad över de mikrokärl är noggrant kontrollerade. Mätningar av hydraulisk konduktivitet först med hjälp av en kontroll perfusat, sedan efter återkanyle av samma mikrokärls med test perfusat möjliggör parade jämförelser av mikrokärls respons under dessa väl kontrollerade förhållanden. Försök att utvidga metoden till mikrokärl i tarmkäx från möss med genetiska modifieringar förväntas ändra kärlpermeabilitet var starkt begränsad på grund av avsaknaden av långa raka och ogrenade mikrokärl i musen tarmkäxet, men den senaste tillgången på råttorna med liknande genetiska modifieringar med hjälp av den crispr / Cas9 tekniken förväntas öppna nya områden för utredning där de metoder som beskrivs häri kan tillämpas. </p>

Introduction

Microperfusion i kärlsystemet innebär fastställande kontrollerat flöde av en artificiell perfusatet med känd sammansättning via en mikropipett i ett blodkärl vanligen mindre än 40 pm i diameter. Den perfusion fartyget ligger inom dess normal vävnad miljö och perfusion med djurets blod fram till tidpunkten för kanyle. När den används tillsammans med ett område av video avbildning eller fluorometriska metoder de situ microperfusion möjliggör mätning av vatten och lösta strömmar över väggarna av mikrokärl under betingelser där de drivande krafterna för dessa flöden är kända och de permeabilitetsegenskaper hos kärlväggen kan direkt utvärderas. Vidare, genom att styra sammansättningen av vätskan som omger mikrokärls i vävnaden (perfusat och superfusate), reglering av mikrokärls permeabilitet och utbyte kan undersökas genom att endotelcellerna bildar mikrokärlsväggen att utsättas för en mängd olika experimental förhållanden (agonister, modifierade perfusion, fluorescerande indikatorer för att mäta intracellulära sammansättning och signalering) för att exakt uppmätta tidsperioder (sek till hr). Dessutom kan ultra eller cytokemiska utvärderingar av viktiga cellulära molekylära strukturer som reglerar barriären undersökas i samma mikrokärl där permeabilitet är direkt mäts. Tillvägagångssättet bildar därmed en brygga mellan utredning av de cellulära och molekylära mekanismer för att modifiera endothelial barriärfunktion i odlade endotelceller cellmonoskikt och utredning i intakta mikrokärl. Se följande recensioner för vidare utvärdering ^1-6.

En begränsning av microperfusion är att det kan endast användas i mikrovaskulära sängar som är tunn, genomskinlig och har tillräcklig strukturell integritet för att möjliggöra kanyle med ett glas mikropipett. Medan tidiga undersökningar används groda mikrokärl i tarmkäxet och tunna kutan pectoris muscle ^7,8, den i särklass mest använda preparatet i däggdjursmodeller är råtta tarmkäxet ^9-15. De flesta undersökningar har fokuserat på akuta förändringar i vaskulär permeabilitet studerades under perioder av 1-4 timmar, men senare undersökningar har utökats till mätningar på enskilda fartyg 24-72 timmar efter en initial perfusion ^12,16. Den nyutvecklade crispr teknik, som lovar att göra mer genetiskt modifierade råttmodeller för att studera vaskulär permeabilitet reglering ¹⁷ bör möjliggöra de metoder som beskrivs i detta meddelande som skall tillämpas i venular mikrokärl i tarmkäxet i dessa viktiga nya råttmodeller.

Metoden kräver ett inverterat mikroskop utrustad med en specialbyggd mikroskop skede stor nog att rymma både djuret preparatet och minst tre mikromanipulatorer används för att positionsmikroverktyg nära perfusion fartyget och att anpassa en perfusion mikropipett med fartygetlumen. Exempelvis en anpassad plattform för en xy mikroskop skede (ca 90 x 60 cm) kan tillverkas av en 1 cm tjock stålplåt med en rostskyddad beläggning. Scenen är fäst vid en ingenjörsindextabell eller två dove-tail glas monterade i rät vinkel och uppburna på Teflon pelare eller boll överföringar för rörelse i horisontalplanet. En typisk rigg (se figur 2) har mycket gemensamt med mikroskop och mikropositioneringsutrustning som används för en rad intravital mikrocirkulation experiment såsom de att mäta enda kärl blodflödet och hematokrit, lokal syretillförseln genom blod perfusion mikrokärl, reglering av vaskulär glatt muskeltonus, och den lokala mikrovaskulära ansamling av fluorescerande spårämnen injiceras i hela cirkulationen. ^18-26

Den grundläggande aspekten av tekniken är mätning av volymflödet (J _v) över en definierad yta (S) i microvessel väggen. Att uppnådetta via den modifierade Landis tekniken beskriven häri en enkel inverterat mikroskop är tillräckligt. En liten videokamera är monterad på bildporten och videosignalen, med ett tillsatt tidsbas, visas på en videomonitor och registreras antingen i digital form på en dator eller som en digital eller analog signal på en videobandspelare. När väl mikrokärlskanyleras den del av mikrokärls synlig för kameran kan ändras genom att flytta scenen och manipulatorer som en enhet utan att störa kanyler.

Mätning av transvaskulär flöden kan också kombineras med mer detaljerade undersökningar med hjälp av en sofistikerad fluorescensmikroskop med lämpliga filter som riggar används för mätning av lösta ämnen permeabilitet, fluorescerande förhållande övervakning av cytoplasmiskt kalcium eller andra cellulära mekanismer, och konfokal avbildning ^{6,12,13, 27.} En viktig fördel med alla microperfusion metoder är förmågan att göra upprepade mätningar på samma fartygUnder kontrollerad förändring av drivkraft som hydrostatiska och onkotiska tryck, eller inducerade förändringar i fartygs svar på inflammatoriska tillstånd. Den vanligaste konstruktionen är en parad jämförelse av uppmätt hydraulisk konduktivitet (L _p) på samma fartyg med fartyget först perfusion via en mikropipett fylld med en styr perfusat och den röda cellsuspensionen för att etablera en baslinje permeabilitet stat, med en andra pipett med testmedlet till perfusatet. Flera kanyle är möjligt med cykeln upprepas efter reperfusion med kontroll pipett.

Föreliggande protokoll visar kanyler och mikroperfusionskammaren av en venular kärl i rått tarmkäxet att registrera vatten flöden över mikrokärlsväggen och mäta _Lp av kärlväggen, ett användbart index på permeabiliteten av den gemensamma vägen för vatten och lösta ämnen tvärs den intakta endotelial barriär. Förfarandet kallas den modifierade Landis technique eftersom den ursprungliga Landis principen att använda den relativa rörelsen av röda celler som ett mått på transvaskulär vätskeutbytet efter perfusionen är blockerad bevaras ^28, men området av experimentella betingelser (t.ex., de hydrostatiska och albumin onkotiska tryckskillnader över hela mikrokärlsväggen) tillgänglig efter microperfusion är mycket större än i uncannulated blod perfusion mikrokärl ^8,29.

Protocol

Etik uttalande: Alla förfaranden har granskats och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Inledande Tillverkning av mikropipetter, rörelsehindrande och blockering Dra flera rena borosilikatglas kapillärrör i halv användning av en elektronisk avdragare justeras så att, när den dras, är den sträckta delen av röret ungefär en cm i längd och de två halvorna är något symmetrisk. Se till att avsmalningen är förenlig med måtten i f…

Representative Results

Figur 4 visar resultaten från mätning av tidsförloppet av förändringar i L p i en råtta venular mikrokärls kanyl successivt med fyra perfusat. 33 Storleken av L p beräknas vid en konstant tryck användes som ett mått på förändringar i microvessel vägg permeabilitet, först i kontroll tillstånd med en perfusat innehållande 1% bovinserumalbumin sedan när fartyget utsattes för inflammatoriska medlet bradykinin (Bk) med en andra mikropipett innehållande 10 …

Discussion

Uppgifter om L _s beräkningar. Även transvaskulär vätska rörelse uppstår när fartyget är fritt perfusion, är sådant utbyte alldeles för liten för att mätas vid fri perfusion eftersom det är typiskt mindre än 0,01% av fartygets perfusionshastigheten. När emellertid perfusion transient stoppas genom ockluderar mikrokärls, transvaskulär flöde (dvs filtrering) mäts från förflyttning av markör röda celler i lumen som kolonnen av vätska mellan en markör av röda celler och…

Materials

MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform–1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio–generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray–needs cord and controller–240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope–see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back–can be purchased from Amazon