שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em> Falciparum Plasmodium</em

Summary

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Abstract

הווריאציה הגנטית אחראית לאלל חרמשית (HBS) מאפשרת אריתרוציטים להתנגד זיהום על ידי טפיל המלריה, פ falciparum. הבסיס המולקולרי של התנגדות זו, אשר ידועה להיות גורמים מרובים, נשאר הבין באופן חלקי. מחקרים שנעשה לאחרונה מצאו כי ביטוי ההפרש של מיקרו RNA כדורית אדומה, translocated פעם לטפילי מלריה, להשפיע הן ויסות הגנים וצמיחת טפיל. miRNAs אלה מאוחר יותר הוצג לעכב תרגום mRNA על ידי יצירת תעתיקי הרנ"א chimeric באמצעות 5 היתוך 'RNA עם תת דיסקרטי של mRNAs טפיל. כאן, בטכניקות ששמשו כדי ללמוד את התפקיד הפונקציונלי ומייקרו-רנ"א כדורית אדומה המשוער מנגנון הבסיסי על ויסות הגנים ופוטנציאל translational של פ falciparum, כולל transfection של מיקרו RNA הסינתטי שונה לאריתרוציטים מארח, שיפורט. לבסוף, שיטת שיפוע polysome משמשת כדי לקבוע את מידת translation של תמלילים אלה. יחד, טכניקות אלה אפשרו לנו להוכיח כי רמות dysregulated של מיקרו RNA כדורית אדומה תורמות להתנגדות מלריה תא הפנימי של אריתרוציטים מגל.

Introduction

מלריה, הנגרמת על ידי טפילי apicomplexan של הסוג Plasmodium, היא המחלה טפילית האנושית הנפוצה ביותר, בעולם מדביק כ -200 מיליון אנשים בכל שנה וגורם למותם סביב 600,000 ^1. של חמישה מיני Plasmodium שלהדביק בני אדם, הרלוונטי ביותר למחלות של בני אדם הוא פ falciparum ופ vivax, בשל ההפצות שלהם נרחבות ופוטנציאל לסיבוכי מלריה חמורים. מחזור החיים של טפיל המלריה דורש זיהום של שני יתושים ובני אדם. כאשר יתוש נגוע נושך אדם, הטפילים לנסוע דרך מחזור הדם אל הכבד, שבו עגול של שכפול ראשוני מתרחש. לאחר merozoites קרע מhepatocyte המארח, הם להדביק תאי דם אדומים סמוכים, ייזום שכפול או מיני או מיני. השלב מיני של שכפול, שנמשך 48 שעות בפ falciparum, הוא המוקד של מחקר זה מאחר שהוא גם המקור של רוב malסימפטומים ואריה הוא סכמו בקלות במבחנה.

בעוד מספר יוזמות בריאות ציבור, לרבות טיפולים נגד מלריה השתפרו, יש מעט הפחית את הנטל של המלריה בעולם, את הופעתה המתמשכת של טפילים עמידים סמים מהווה בעיה עבור מאמצי שליטת מלריה. תחום אחד שיכול להציע גישות טיפוליות חדשות הוא המחקר על איך שונים וריאנטים גנטיים להקנות עמידות למלריה. באזורים נגועים מלריה, מגוון רחב של פולימורפיזם האריתרוציטים הם די נפוץ ^2,3. מוטציות אלה, עם חרמשית להיות אולי הבולטים ביותר, הקשורים לעתים קרובות עם התנגדות משמעותית להתפרצות של זיהום המלריה סימפטומטי ^4. המנגנונים שבאמצעותם הם גורמים אריתרוציטים להתנגד זיהום מלריה הם הבינו באופן חלקי. אריתרוציטים parasitized עם מוטציות המוגלובין כפופים להרס עצמי משופר באמצעות קשיחות משופרת סלולרית והתייבשות, שמזוהה עם פלישת ירד ב פ falciparum ^5. אלל HBC משפיע גם על ביטוי חלבון על פני השטח כדורית אדומה ועם שיפוץ של שלד התא, עיכוב התפתחות טפילה ^6,7 נוסף. לבסוף, פ falciparum גדל היטב במגל הומוזיגוטים (HBSS) אריתרוציטים ^8,9 במבחנה, המצביעים על גורמי האריתרוציטים פנימיים של התנגדות מלריה. עם זאת, בעוד שכל מנגנונים אלה מופיעים לתפקיד, הם לא מסבירים באופן מלא את המנגנונים מאחורי התנגדות חרמשית למלריה.

סט פוטנציאלי אחד גורמי האריתרוציטים שיישארו הבין היטב הוא המאגר הגדול של הווה מירנה בתוך אריתרוציטים בוגרים. מיקרו RNA הוא RNA קטן קידוד-עישון, 19-25 NT בגודל, אשר מתווך תרגום ו / או יציבות של mRNAs היעד על ידי זיווג בסיס ב'UTR 3. הם היו מעורבים בשליטה של ​​תגובות חיסוניים של יונקים, כוללים הדיכוי oו וירוס שכפול ^10, והוצגו להקנות עמידות לוירוסים בצמחים הם גם הוכחו להסדיר כמה תהליכי האריתרוציטים, כוללים כדוריות דם אדום ^11,12 וחילוף חומרי ברזל ^13. מחקרים קודמים זיהו אוכלוסייה עשירה ומגוונת של miRNAs האריתרוציטים, ביטוי שהיה שינה באופן דרמטי בHBSS אריתרוציטים ^14,15. מאז אריתרוציטים בוגרים חסרי שעתוק ותרגום פעילים, התפקיד הפונקציונלי של miRNAs כדורית אדומה אלה עדיין לא ברור. כתמורה חומרית משמעותית מתרחשת בין התא המארח ופ falciparum במהלך המחזור ההתפתחותי intraerythrocytic (IDC) ^16, שהעריך כי פרופיל מירנה שינה בתוך אריתרוציטים HBS עשוי תורם ישירות להתנגדות מלריה תא פנימי.

מחקרים אלה הובילו בסופו לפיתוח של צינור לבודד, לזהות ותפקודי ללמוד את התפקיד של מירנה אדם בתוך מ 'טפיל alaria, פ falciparum, אשר ציין כי miRNAs אדם המארח / אלה סופו של דבר קוולנטית נתיך ולאחר מכן translationally להדחיק תעתיקי mRNA טפיל ^17. זה סיפק דוגמא של התמלילים הראשונים בין מיני chimeric נוצרו על ידי טרנס שחבור ומפליל שהיתוך מירנה-mRNA זה יכול להיות מתרחש במינים אחרים, כוללים טפילים אחרים. כל mRNAs trypanosome הם עם אחוי-מנהיג (SL)-שחבור טרנס להסדיר את ההפרדה של תמלילי polycistronic ^18. מאז פ falciparum חסר orthologs לדייסר / לפני ^19,20, זה אפשרי, כי miRNAs כדורית אדומה לחטוף מכונות SL דומות בפ falciparum להשתלב גני המטרה. מחקרים שנעשה לאחרונה בפ falciparum יש למעשה הצביע על הנוכחות של 5 רצפים 'מנהיג אחוי ^21. מחקר זה מפרט את השיטות שהובילו לגילוי של תמלילי היתוך אנושי-טפיל מירנה-mRNA, כולל שני transcriptomic ותרגומיםטכניקות רגולציה tional. המטרות הכללית של שיטות אלה הן לחקור את ההשפעות של RNA הקטן בפוטנציאל ויסות הגנים, פנוטיפים ותרגום של פ תמלילי falciparum.

זיהוי הראשוני של תמלילי chimeric אדם טפיל לסמוך על שימוש בטכניקות ניתוח RNA, כמו בזמן אמת PCR, רצף transcriptome ולכידת ספריית EST, שכלל שני RNAs כולל וקטן, ולא תוך שימוש בטכניקות שרק מבודדת RNA קטן. בידוד כל RNA יחד בבריכה אחת גדולה, ולא בנפרד, אפשר זיהוי של שני RNA הקטן אדם translocated בטפיל, כמו גם נוכחות של רצפי RNA הקטנים אלה כחלק מרצף גדול יותר. אז זה נדרש ניתוח של מצב התרגום של mRNAs ההיתוך אלה כדי לקבוע את ההשלכות התפקודיות של שילובים אלה.

בעוד מאמצים רבים באפיון הגנום של הטפילtranscriptome ד הוסיפה להבנת הביולוגיה של הטפיל ^22-25, הרבה פחות ידוע על תקנת translational של transcriptome mRNA על פני מחזור החיים של פ falciparum ^26. הבנה מוגבלת זו של proteome של הטפיל הפריעה שתי הבנה של הביולוגיה של הטפיל ואת היכולת לזהות מטרות חדשות עבור הדור הבא של תרופות נגד מלריה. פער בהבנה של הביולוגיה התאית של הטפיל זה נמשך במידה רבה בשל חוסר טכניקות נאותות לחקור רגולציה translational בפ falciparum. נייר האחרון אחד תאר את השימוש בfootprinting ריבוזומלי של פ falciparum כדי לקבוע את מצב התרגום העולמי ^21. אחת מדידה מבוססת היטב של פוטנציאל translational של תמלילים היא מספר הריבוזומים קשורים נקבעים על ידי polysome פרופיל. עם זאת, כאשר טכניקה זו מיושמת לפ falciparum </ Em>, זה לא יכול לשחזר את רוב polysomes ולוכד בעיקר monosomes. לאחרונה, מספר קבוצות ^27,28 אופטימיזציה פ טכניקות polysome falciparum ידי lysing כדורית אדומה וטפיל בו זמנית לשמור על polysomes ולאפיין את תפוסת ריבוזומלי ופוטנציאל translational של טפילי מלריה אלה במהלך ההתפתחות מינית שלהם בתאים אדומים מארח ^28.

באופן קולקטיבי, שיטות אלה להוכיח כי ההיתוך הנצפה של mRNAs מירנה והטפיל האנושי מודולציה תרגום חלבון טפיל של mRNAs ההיתוך אלה, שהודגם בשיטות שדווחו בעבר ^27, והוא הקובע עיקרי של התנגדות מלריה בHBAs וHBSS אריתרוציטים ^17. שיטות אלה יהיו שימושיות בכל מערכת מחפשת לזהות ופונקציונלי לחקור אירועי שחבור רנ"א, אם RNAs ההיתוך אלה נמצאים בפ falciparum או מערכות אחרות אוקריוטים.

Protocol

1: בידוד של RNAs הקטן בגודל מפ falciparum במהלך IDC להשיג טפילי מלריה בתרבות מינית 29. הערה: גודל התרבות הנדרשת ישתנה מבוסס על היישום הרצוי; עם זאת, תרבות 10 מיליליטר בהמטוקריט 3-5 parasitemia% ו -5% מספקת RNA בשפע בזמן אמת PCR (RT…

Representative Results

פרופיל עולמי של microRNA האנושי בפ falciparum הטכניקות שהוצגו כאן שמשו כדי לחלץ מיקרו-רנ"א מטפילים במגוון רחב של מצבים. דבר אחד שיש לציין הוא כי עקירות RNA לRBCs נגוע בוצעו כפי שצוינה ב -32, אשר לעתים קרובות שימשו כנקודת התייחסות ל?…

Discussion

HBS הוא אחד גרסאות המוגלובין הנפוצות ביותר באזורים אנדמיים למלריה, במידה רבה משום שהוא מספק הגנה מפני מלריה חמורה שנגרמה על ידי פ ' falciparum. הטכניקות דרושות כדי לאפיין את התפקיד של microRNA האנושי בויסות הגנים של פ falciparum מפורטים בכל כתב היד הזה. על ידי מיצוי RNA הכו?…

Materials

REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.

Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758)

DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)

Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher)

Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad)

0.2 cm Electroporation cuvettes

4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700)

2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527)

1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545)

1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000)

100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626)

10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021)

10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750)

Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698)

Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04)

RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)

RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV)

10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039)

Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060))

HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)

45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)

1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)

1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)

Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)

Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)

Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)

mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).

5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)

Biotin powder (Sigma-Aldrich)

1M Potassium Chloride

Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)

Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)

Lysis buffer (see REAGENT SETUP)

15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)

60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)

Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)

RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)

RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)

REAGENT SETUP

Solutions

Plasmodium cell culture media

500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine

0.5 ml gentamicin

5 ml HT supplement

2.5 ml 45% glucose

25 ml 10% AlbuMAX I

12.5 ml 1 M HEPES

Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.

Plasmodium cell culture media containing 10x CHX

Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:

2 mM cycloheximide

Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.

1x PBS containing cycloheximide

Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.

Ribosome resuspension buffer

400 mM potassium acetate

25 mM potassium HEPES, pH 7.2

15 mM magnesium acetate

200 mM cycloheximide (add fresh)

1 mM DTT (add fresh)

1 mM PMSF (add fresh)

40 U/ml RNaseOUT (add fresh)

Lysis buffer

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:

1% (v/v) Igepal CA-630

0.5% (w/v) DOC

Sucrose solutions

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:

15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution

50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution

0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion

As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.

The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components

60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution

RNA Capture Wash Buffer

20mM  KCl

5unit/ml Rnase Out (Invitrogen)

RNA Capture Elution Buffer

Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:

2mM Biotin

EQUIPMENT

SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)

SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)

Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)

Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)

L8-80M ultracentrifuge (Beckman)

Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378)

1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)

5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)

Parafilm

Tube rotator, end-over-end

Microcentrifuge, refrigerated

Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)

TracerDAQ (Measurement Computing)

Eppendorf 5810R centrifuge

Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)