Quantification des souches du côlon mutations de cellules

Summary

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Abstract

La capacité de mesurer les mutations de cellules souches est un outil puissant pour quantifier dans une population de cellules critique si, et dans quelle mesure, un produit chimique peut induire des mutations qui conduisent potentiellement à un cancer. L'utilisation d'un dosage enzymatique pour quantifier des mutations de cellules souches dans le gène de la glucose-6-phosphate-déshydrogénase liée au chromosome X a été indiqué précédemment. ¹ Ce procédé nécessite la préparation de coupes congelées et incubation du tissu sectionné avec un mélange de réaction qui donne un couleur bleue si les cellules produisent fonctionnelle glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) enzyme. Si non, les cellules apparaissent blanchâtres. Nous avons modifié le mélange réactionnel en utilisant Optimal Cutting Temperature composé (OCT) moyen à la place de l'alcool de polyvinyle. Ceci facilite la mesure de pH, augmente la solubilisation des composants de coloration de la G6PD et limite la diffusion de l'enzyme G6PD. Pour démontrer que la mutation a eu lieu dans une cellule souche, l'ensemble doit crypte manque G6PD enzymatiqueactivité. Seulement si une cellule souche abrite une mutation G6PD phénotypique sera tout de la descendance dans la crypte manquer activité enzymatique en G6PD. Pour identifier les cryptes avec une mutation de cellules souches, quatre coupes congelées adjacentes consécutives (un niveau) ont été coupées à 7 um d'épaisseur. Cette approche de faire des coupes adjacentes conformation qui fournit une crypte a été entièrement muté depuis la même crypte muté sera observée dans les sections adjacentes. Diapositives avec des échantillons de tissus qui étaient plus de 50 um part étaient prêts à évaluer d'un total de> 10 ⁴ cryptes par souris. La fréquence de mutation est le nombre de mutés (blanc) cryptes Observée ÷ par le nombre de type sauvage (bleu) cryptes dans un groupe de traitement.

Introduction

Le cancer du côlon est pensé pour impliquer une exposition à des agents environnementaux et composants alimentaires qui peuvent endommager l'ADN et de produire des mutations activatrices somatiques dans oncogènes (par exemple, la ß-caténine) ou d'inactiver les mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs (par exemple, APC). On suppose que ces mutations se produisent dans les cellules critiques souches du côlon. En raison de l'architecture de la crypte unique de l'épithélium du côlon, il est possible de mesurer des mutations de cellules souches dans le côlon après avoir exposé les animaux à des produits chimiques associés à la cancérogenèse colique. Plusieurs enzymes liées au chromosome X peuvent servir d'indicateurs pour des mutations qui se produisent dans les cellules souches, comme les mutations seront présentes dans toutes les cellules au sein d'une crypte.

Auparavant, une procédure a été publiée démontrer que les produits chimiques qui induisent des tumeurs du côlon chez les souris générées également des mutations de cellules souches somatiques dans le côlon par l'intermédiaire d'une analyse de mutations de la glucose-6-phosphate déshydrogénase liée à l'X (G6PD) gène ^1-3.La méthode quantifie l'incidence des mutations somatiques aléatoires dans les cellules souches du côlon sans aucune pression de sélection. La procédure implique la production de sections congelées non fixées du côlon de souris traitées et de contrôle et l'identification des cryptes dépourvues de cellules qui produisent l'activité de la G6PD fonctionnel. Ces cryptes mutées, qui apparaissent blancs, indiquent que la mutation a eu lieu dans une cellule souche qui a donné lieu à une progéniture hébergeant également gène G6PD mutant. Dans le dosage enzymatique, G6PD mutant déficient cryptes peuvent pas oxyder le glucose-6-phosphate, qui est nécessaire pour la réduction du nitro bleu de tétrazolium (NBT). Lorsque l'enzyme est fonctionnelle en G6PD, le NBT dans le mélange de coloration est réduite à formazan insoluble et précipités, l'accumulation à l'emplacement de l'enzyme et des cellules "bleues" de coloration. Les cellules qui sont des mutants de la G6PD restent blanchâtre à la différence de cryptes colorés bleus de type sauvage. Cette méthode permet de mesurer les mutations qui ont un phénotype «nulle». Parce que enenzymes, comme la G6PD, peut diffuser hors des cellules sur une section de tissu non fixé si les articles sont placés dans une solution aqueuse, il est nécessaire de stabiliser l'enzyme dans les sections de tissu à analyser. ⁴ La stabilisation de l'enzyme dans le le tissu ne doit pas interférer avec la diffusion de petites molécules nécessaires à la réaction enzymatique en G6PD de réactifs.

Nous avons fait un certain nombre de changements importants dans la procédure initiale. Le milieu pour la coloration enzymatique critique a été modifié à partir de l'alcool polyvinylique à Optimal Cutting Température composé (OCT), ce qui facilite le contrôle du pH et la solubilisation des composants utilisés dans l'essai. La coloration est effectuée en utilisant 0,4 – 0,5 ml puits en rondelles en acier de sorte que chaque section de tissu a reçu le même volume de mélange de réaction de la G6PD. Une procédure a été développée pour estimer le nombre de cryptes dans une section imagée qui fournit un grand échantillonnage du tissu du côlon, sans avoirde compter manuellement> 10 ⁵ cryptes pour chaque colon. L'analyse des coupes de tissus adjacents 7 um permet la visualisation d'une crypte mutant sur plus d'un coulisseau, ce qui permet de réduire des artefacts de coloration potentiels. Ces changements rendent la procédure plus efficace et reproductible.

En utilisant ce protocole révisé, nous avons quantifié la fréquence de mutation dans les cellules souches du côlon après exposition des souris C57BL / 6 à azoxyméthane, un cancérogène du côlon bien connu chez les rongeurs. ^5-7

Protocol

Les procédures expérimentales et traitement éthique des animaux a été approuvé par l'Université de Pittsburgh IACUC (protocole # 1104674). 1. Préparation de la G6PD coloration Mélange NOTE: Assurez-vous que la concentration finale de chacun des réactifs est la suivante; 5 mM de glucose-6-phosphate (G6P); 2 mM de NADP, 5 mM de MgCl2, 1 mM de 0,35-méthoxy-5-méthylphénazinium sulfate de méthyle (MMPMS) et 0,8 mM NBT. 1,8,9 Pour chaque réactif, la c…

Representative Results

La capacité de mesurer les mutations de cellules souches du côlon chez les animaux offre un moyen unique de corréler des mutations à l'induction du cancer. Normalement, il est supposé que l'étape critique dans la carcinogenèse implique l'activation des mutations dans des oncogenes et / ou inactiver les mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs. Nous avons injecté souris C57BL / 6 avec 200 pl de PBS ou de 10 mg / kg AOM dans 200 ul de PBS. AOM est un cancérogène du côlon connue. 5-7</s…

Discussion

Souvent l'effet génotoxique d'un composé est déterminée par sa capacité à modifier l'ADN. Cela se fait normalement en isolant le tissu et la mesure du niveau global d'adduits d'ADN. Pour AOM, cela impliquerait quantifier O ⁶ -méthylguanine adduits dans le côlon. En utilisant cette information d'approche sur les dommages dans des types cellulaires spécifiques, comme dans la niche de cellules souches, est perdu. En outre, un produit d'addition d'ADN est pas de même d&#3…

Materials

reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room