We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.
العديد من الكائنات الدقيقة قادرة على إنتاج وإفراز exopolysaccharides (EPS)، والتي لها آثار هامة في المجالات الطبية وتطبيقات المواد الغذائية أو في استبدال المواد الكيميائية على أساس النفطية. وصفنا منصة التحليلية ليكون آليا على نظام التعامل مع السائل الذي يسمح للتحليل سريع وموثوق بها من نوع ومقدار العائد على السهم تنتجها الكائنات الحية الدقيقة. انها تمكن المستخدم من تحديد رواية المنتجين exopolysaccharide الميكروبي الطبيعي وتحليل بصمة الكربوهيدرات من البوليمرات المقابلة خلال يوم واحد في الإنتاجية العالية (HT). باستخدام هذه المنصة، ومجموعات الضغط وكذلك المكتبات من المتغيرات السلالة التي يمكن الحصول عليها في مناهج الهندسة ويمكن فحص. منصة لديها الإعداد وحدات، والتي تسمح للفصل البروتوكول إلى قسمين رئيسيين. أولا، هناك نظام الفرز الآلي، الذي يجمع بين مختلف وحدات الكشف السكاريد: تحليل شبه كمي لviscositتشكيل ذ عبر خطوة الطرد المركزي، وتحليلا للتشكيل البوليمر عبر هطول الأمطار الكحول وتحديد المحتوى الكلي لمجموع الكربوهيدرات عن طريق التحول الفينول الكبريتيك الحمضية. هنا، فمن الممكن أن يحجب ما يصل الى 384 سلالات في التشغيل. ويقدم الجزء الثاني تحليل أحادي السكاريد مفصل لجميع المنتجين EPS اختيار المحددة في الجزء الأول من خلال الجمع بين اثنين من وحدات أساسية هي: تحليل تكوين مونومر كاملة عن طريق فائقة الأداء اللوني السائل إلى جانب فوق البنفسجية وتأين بالإرذاذ الإلكتروني كشف مصيدة أيون ( UHPLC للأشعة فوق البنفسجية-ESI-MS)، وتحديد البيروفات باعتبارها المستبدلة البوليمر (وجود كيتال البيروفات) عن طريق الأكسدة الأنزيمية أن يقترن إلى تشكيل اللون. جميع الوحدات التحليلية من هذا المنبر الفحص ويمكن الجمع بين بطرق مختلفة ويتم تعديلها لتلبية الاحتياجات الفردية. بالإضافة إلى ذلك، فإنها يمكن أن تكون جميع التعامل معها يدويا أو يؤديها مع نظام التعامل مع السائل. وبالتالي، فإن جيش التحرير الشعبى الصينى فحصtform يتيح مرونة هائلة من أجل تحديد EPS المختلفة.
exopolysaccharides الميكروبية (EPS) هي مجموعة متنوعة للغاية من الناحية الهيكلية من البوليمرات التي تلبي الوظائف البيولوجية المختلفة. وعادة ما يتم بناؤها من وحدات تكرار المعقدة، والتي تتميز أنواع مختلفة من أحادية (السكر ومشتقات السكر والأحماض السكر)، والروابط بين هذه مونومرات وبدائل لهم. التنوع الهيكلي من السكريات الميكروبية يمنح خصائص مختلفة وليس لأعضاء هذه الفئة جزيء، والذي يسمح تطبيقها في مختلف المجالات مثل المواد الغذائية 1، ومستحضرات التجميل 2،3، بناء الكيمياء 4 أو 5 لمعالجة المياه. لتوسيع مجال تطبيق هذه البوليمرات الحيوي القائم وهذه المستدامة تحديد السكريات الميكروبية الطبيعية رواية فضلا عن الهندسة من المتغيرات الهيكلية يمثل النهج الواعدة. وفي كلتا الحالتين، لا بد من طريقة فحص سريع بسرعة لمسح عدد كبير من سلالات ميكروبية لtheiص تشكيل السكاريد، وتحليل منتجاتها. لذلك، وقد وضعنا مؤخرا 96-كذلك منصة HT-فحص لتحليل الإنتاج السكاريد الميكروبي من العزلات الطبيعية أو متغيرات سلالة هندسيا يتضمن تحديد تكوين أحادى 6.
تطبيق هذا النظام الأساسي لجولة الفحص الأولى من ~ 500 العزلات الطبيعية يسمح لنا بتحديد فقط حوالي 10 إلى 20٪ من سلالات معزولة عن كونه قادرا على إنتاج EPS (لا تظهر البيانات). وهذا يعني أن 80-90٪ من سلالات تحليلها لم تسفر EPS وفقا للشروط تطبيقها، وبالتالي، كان مزيد من التحليل للبصمة مفصلة الكربوهيدرات ليست ضرورية. وبما أن هذا التعريف متطورة للغاية في تكوين أحادى هي عملية تستغرق وقتا طويلا، وخاصة لتحليل البيانات، سريع طريقة الفرز المسبق لتحديد السلالات إيجابية في إنتاج EPS، من شأنه أن يزيد بشكل كبير من كفاءة. وعلاوة على ذلك، الكواشف،وسوف يخفض المواد الاستهلاكية وقياس الوقت في UHPLC للأشعة فوق البنفسجية-ESI-MS. بالإضافة إلى ذلك، وحدات تحليلية مختلفة، في حين من جهة جعل طريقة موثوق بها للغاية، هي من ناحية أخرى يعقد المناولة اليدوية لأكثر من اثنين من لوحات 96-جيدا في موازاة ذلك، وعلى هذا النحو تقييد القدرة الكاملة للطريقة. لهذه الأسباب، قررنا تطوير منصة الفرز الآلي. ولذلك، فإننا الجمع بين شكل وحدات من تقنية الكربوهيدرات بصمة القائمة مع طريقة كشف سريع مؤتمتة بالكامل من المحتوى الكلي السكر، على أساس قياس الامتصاصية.
طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية لا تزال تمثل الطريقة المفضلة لتحديد سريع من إجمالي محتوى الكربوهيدرات من البكتريا والنبات السكريات 7،8. وقد وصفت هذه الطريقة لأول مرة دوبوا وآخرون. (9) وتكييفها لمختلف التطبيقات وأحجام العينات، وحتى على نطاق صغير في لوحات 96-جيدا 10،11. وPHEيقيس طريقة نول-الكبريتيك الحمضية محتوى الكربوهيدرات الكلي من حيث القيمة واحد، summating كل أحادى، بلازميدة قليلة القسيمات والكربوهيدرات البوليمرية من العينات.
أخذ هذه الجوانب في الاعتبار، واختيار وسيلة مناسبة زراعة ضروري لتطبيق هذا الأسلوب. وسائل الإعلام المعقدة التي تحتوي على بلازميدة قليلة القسيمات أو مركبات الكربوهيدرات البوليمرية مثل خلاصة الخميرة قد يؤدي إلى محتوى البوليمر تغيير، وبالتالي، يجب بدقة تجنبها. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام كميات عالية من السكريات مثل C-مصدر لزراعة السلالات. مستويات عالية من الكربوهيدرات المتبقية من عملية زراعة قد تتدخل سلبا مع قياس محتوى EPS.
لذلك، ينصح استخدام السكريات محددة ونقية. في تجاربنا كنا الجلوكوز لزراعة الخلايا. تم تخفيض مستوى السكر المتبقية بعد زراعة عن طريق هلام الترشيح وتحديد طريق الجلوكوز الفحص. وأخيرا، أي ما يعادل نسبة الجلوكوزوحسبت الصورة من السكريات عن طريق طرح الجلوكوز المتبقية بعد هلام الترشيح من المحتوى الكلي لمجموع الكربوهيدرات التي تم الكشف عنها باستخدام طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية. هلام الترشيح والجلوكوز فحص في تركيبة مع طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية ضمان نتائج يمكن الاعتماد عليها وتكون قادرة على أن تكون الأولى، ونظام الكشف لدينا مؤتمتة بالكامل.
وأدرجت اثنين من وحدات تحليلية جديدة في منصة الفرز الآلي لزيادة كمية المعلومات من نظام EPS-كشف: هطول الأمطار ومراقبة زيادة اللزوجة.
العديد من EPS مختلفة – على سبيل المثال succinoglycan، زنتان والقولون حمض 12 – تشير التقارير إلى أن يتم تعديل مع غير الكربوهيدرات البيروفات كيتال على مواقع السكر C4 و C6. تلك ketals البيروفات (تماما كما استرات succinyl نصف والأحماض uronic) المساهمة في طبيعة polyanionic وبالتالي، إلى prope البدنيrties من البوليمر من خلال التفاعل عبر الجسور ثنائي التكافؤ الموجبة 13. من أجل تحديد تلك البوليمرات خاصة تأسست تحديد البيروفات كما وحدة تحليلية إضافية أخرى. وهذا يزيد من المعلومات حول بدائل السكاريد والخصائص العيانية المحتملة.
الجمع بين جميع الوحدات تمكن من تحديد EPS مختلفة فضلا عن تقرير سريع وفعال من المنتجين EPS. من خلال هذا النهج على منصة الفحص يمكن تقسيمها إلى قسمين رئيسيين (الشكل 1). ضمن الفرز الآلي (الجزء الأول) سير العمل يحدث مؤتمتة بالكامل (الجدول 1) إلى تحديد مسبق بسرعة EPS إنتاج السلالات. تحليل الكربوهيدرات بصمة (الجزء الثاني) تحدد كميا تكوين مونومر من EPS التي تنتجها سلالات انتقاؤه. وبالتالي، تم تصغير تحليل البيانات من أجل تحسين فحص مجموعات سلالة كبيرة. هذاتوفر إمكانية تحليل 384 سلالات في واحدة المدى الفرز الآلي ومع اثنان أشواط التي من الممكن يوميا من 768 سلالات يوميا. بالإضافة إلى ذلك، فإن تحليل الكربوهيدرات بصمة يعطي أكثر تفصيلا لمحة عامة عن كل EPS التي تم تحديدها. وهذا يتيح للتحليل وجهت وتحديد فقط مختلفة قليلا المتغيرات EPS أو جديدة تماما بالمقارنة مع الهياكل الكيميائية التي سبق وصفها من EPS.
كشف السكاريد مع طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية: السكريات الأحادية مختلفة تظهر مختلف ماكسيما الامتصاص ومعامل الانقراض المولي عن طريق استخدام هذه الطريقة 9. وهذا يؤدي إلى امتصاص ماكسيما مختلفة من البوليمرات، والتي تحتوي على العديد من السكريات بكميات مختلفة. ونظرا لأطوال موجية مختلفة من ماكسيما امتصاص لمدة 16 مختلفة البوليمرات المتاحة تجاريا في الجدول 5. وتم حل البوليمرات (1 جم / لتر) في [ده 2 O، أثار (150 دورة في الدقيقة) بين عشية وضحاها ويقاس مع الفينول الكبريتيك، وحامض وطريقة . وأظهرت اللثة Diutan أدنى الحدود القصوى امتصاص عند 470 نانومتر حمض الهيالورونيك وscleroglucan وأعلى مستوى عند 484 نانومتر. وبناء على هذه النتائج تم اختيار 480 نانومتر لهذا النظام الأساسي الفرز. تم احتساب الامتصاصية النسبي للبوليمرات على أساس الامتصاصية التي تم الحصول عليها مع 1 جم / لتر جلوكوز (مجموعة من 100٪). تم الحصول على أدنى النتائج مع scleroglucan وsuccinoglycan، على حد سواء مع 92٪. كان هذا إكسبECTED لscleroglucan يحتوي فقط على الجلوكوز وsuccinoglycan يحتوي على الجلوكوز والجلاكتوز في نسبة 7: 1. كلا البوليمرات التجارية لديها خسائر مختلفة من تجفيف والرماد مختلفة، وهذا هو السبب لماذا لم يتم الوصول إلى القيمة النظرية لل~ 110٪. أظهر الزيلان أعلى الامتصاصية النسبي مع 311٪. والسبب في ذلك هو ارتفاع معامل الانقراض المولي تحقق من زيلوز نتيجة لشكل فورانوز أكثر هيمنة. عند مستوى 0.1 جم / لتر جلوكوز تم التوصل إلى الحد الكمي، فضلا عن الحد كشف بتركيز <0.05 جم / لتر. ومع ذلك، فإن حد الكشف عن سلالات إيجابية في الفحص هو أعلى من 0.7 جم / لتر، وبالتالي، أظهر فحص الأداء الجيد. من أجل الحصول على نتائج موثوقة، تم تحديد نسبة الجلوكوز المتبقية بعد هلام الترشيح مع الجلوكوز فحص وتطرح هذه القيمة من القيمة من طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية.
آلية تخفيف الجلوكوز فحص: أداءمن تقرير الجلوكوز بعد زراعة (التخفيف 1: 100) وكان التحقيق. لهذا، تم نقل 10 ميكرولتر من طاف إلى 990 ميكرولتر من ده 2 O في لوحة بئر عميقة ومختلطة عبر عشر مرات الشفط والاستغناء عن 180 ميكرولتر من هذا التخفيف. وكانت الخطوة الثانية الحاسمة في pipetting لالصحيح قسامة ميكرولتر 5 فقط من أجل تخفيف 1:10 من الجلوكوز فحص بعد هلام الترشيح. من أجل توليد ميكرولتر التخفيف 25 من ده 2 O نقلوا مع 50 ميكرولتر طرف أول، ويستنشق بعد ذلك 20 ميكرولتر من ده 2 O و 5 ميكرولتر هلام الترشيح معا. وهذا يضمن أفضل إزالة قسامة 5 ميكرولتر من طرف. وتم التحقق من كل من خطوات تخفيف مع مختلف مستويات الجلوكوز عن طريق الجلوكوز الفحص. وبالنظر إلى النتائج لمدة تركيزات نموذجية في الجدول 6 في 1: 100 التخفيف لتحديد نسبة السكر بعد أن أظهرت زراعة دقة عالية لكل من المعايير مع السيرة الذاتية & #60؛ 1.2٪. وفي الوقت نفسه، كانت دقة لمستوى أعلى يصل إلى 11.6 (خطأ٪). ومع ذلك، هذا لا يكاد يذكر كما يمثل تقرير الجلوكوز فقط نسبة السكر المتبقية بعد زراعتها وبالتالي، ليس مهما للكشف البوليمر. أظهر تخفيف 01:10 لالجلوكوز المتبقية بعد هلام الترشيح نتائج موثوقة جدا مع السيرة الذاتية <1.4٪ ودقة <خطأ 2.1٪.
النظر في التبخر: الفحص يتطلب 3.5 ساعة من الخطوة الأولى لأول الجلوكوز الفحص. من أجل معرفة ما إذا كان هذا الإطار الزمني له تأثير على تخزين الخطة المتوسطة الأجل لم يسبق لهم اللعب، تم تخزين 50 ميكرولتر من المعايير معايرة سكر الفحص مع وبدون غطاء لمدة 3.5 ساعة في دائري الروبوت. في نطاق معايرة (45 حتي 4،5 ملغ / لتر) تركيز عينة بالكاد زادت. وكانت أقل من 2.1٪ وفقط لمدة أقل تركيز (1.8 و 0.9 ملغم / لتر) وصلت إلى 12.4٪ (- زيادة – الناجمة عن التبخر <strأونج> الجدول 7).
هلام الترشيح: كميات عالية من الجلوكوز غير استقلاب يزعج الكشف الكمي من الجلوكوز من البوليمر تحلل. ولذلك، كان مطلوبا خطوة هلام الترشيح لإزالة الجلوكوز المتبقية بعد زراعة. بالإضافة إلى ذلك، وهلام الترشيح ينقي البوليمر تحتوي على طاف من الأملاح والمركبات الكربوهيدرات أحادى، والبعض الآخر من الجلوكوز، للحد من خلفية تحليلية في التحليل مونومر. في خطوة هلام الترشيح وضعت 35 ميكرولتر من الترشيح في وسط البئر. للتأكد من صحة ومتانة هلام الترشيح في النظام الآلي، ومرشح ثمانية معايير المعايرة من 0.045 يصل إلى 9 ز / L الجلوكوز (ن = 8). تم تخفيض مستوى السكر في كل التركيز دائما من قبل أكثر من 95٪ من القيمة الأولية (الجدول 8). في القيام بذلك، أظهر هلام الترشيح نتائج جيدة للغاية لتركيزات مختلفة من الجلوكوز. بالإضافة إلى ذلك، الجلوكوز المتبقية بعد هلام وتم تحديد iltration أيضا مع الجلوكوز فحص وتطرح من تقرير الفينول الكبريتيك حمض لتلقي المبلغ الصحيح من مكافئ الجلوكوز لالبوليمر تحلل.
البيروفات-فحص: أولا وقبل كل شيء، وكان التحقيق هو ما إذا كان تحييد والمخفف (01:10) TFA مصفوفة من الخطوة التحلل يتداخل مع رد الفعل الأنزيمية. لذلك، تم إجراء فحص كامل مرتين، مرة واحدة مع ومرة واحدة دون المصفوفة وأظهرت نتائج موثوقة. وأخيرا، تم قياس محتوى البيروفات من 16 البوليمرات المتاحة تجاريا بنجاح وصورت في الشكل (3). ومن المعروف عموما أن للخروج من تلك البوليمرات سوى 16 succinoglycan وزنتان يحتوي بشكل طبيعي على البيروفات. مع شركائنا في البيروفات-الفحص تم تحديد كل من هذه البوليمرات بشكل صحيح. في scleroglucan، تم الكشف عن اللثة welan والبيروفات الزيلان أيضا بكميات كبيرة. وعموما، تم التحقق من قدرة النهج والبيروفات-فحص الصورةhowed عالية الأداء. ثبت أن تكون قادرة على الكشف البيروفات في البوليمرات مختلفة بعد التحلل.
بصمة الكربوهيدرات: بعد تنفيذ جميع وحدات تحليلية في الفرز الآلي، وقد تم اختيار المنتجين EPS المحتملين لتحليل الكربوهيدرات بصمات الأصابع. لهذا، تم تطبيق عدة معايير هي: 1) الملاحظة الإيجابية من اللزوجة بعد الطرد المركزي و / أو بعد الترشيح. 2) إن الأمطار قبل وبعد الترشيح. تم تقييم الألياف المرصودة ورقائق بأنها إيجابية. 3) ما يعادل قيمة الجلوكوز من طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية. تم تصنيف القيم> 700 ملغ / لتر بأنها إيجابية وتم تصنيف القيم بين 300 و 700 ملغم / لتر كمنتجين EPS المفترضة. عندما تم تقييم اثنين أو ثلاثة معايير بأنها إيجابية، وقد تم اختيار السلالات لمزيد من التحليل بصمة الكربوهيدرات. معايير يمكن تخصيص نحو الهدف الفردي للEPS الفرز (على سبيل المثال EPS اللزوجة المنخفضة). نهجنا تهدف إلى إيجاد efficiوالأنف والحنجرة EPS المنتجين. عند البحث عن السلالات التي تنتج كميات صغيرة فقط من EPS الحد تقييم ما يعادل الجلوكوز ينبغي تخفيض.
فائدة التقنية والتطبيقات المستقبلية: ميزة واحدة مثيرة للاهتمام من هذا البروتوكول هو الطابع حدات من الخطوات وحدات تحليلية مختلفة. ويمكن الجمع بين بطرق مختلفة مع تعديلها لتلبية الاحتياجات الفردية، ويمكن بسهولة أن تنفذ وحدات جديدة. وعلاوة على ذلك، فإن وحدات تحليلية يمكن استخدامها بشكل منفصل، على سبيل المثال وحدة التحلل في تركيبة مع وحدة HT-PMP-اشتقاق قادرة على إجراء تحليل لبنية أحادى من محاليل البوليمرات المختلفة (1 جم / لتر) في شكل 96-جيدا. للمختبرات دون الوصول إلى نظام مناولة السائل فحص كامل يمكن التعامل معها يدويا دون أي تغيير في نظام pipetting ل. ومع ذلك، باستخدام نظام مناولة السائل يزيد من إنتاجية تصل إلى 768 سلالات (بدلا من 192 سلالات إذا screeneد يدويا) في اليوم الواحد. بروتوكول الموضح هنا هو قادر على فحص للأجناس مختلفة، وبالتالي، لفحص مجموعات سلالة كبيرة لتحديد EPS رواية المنتجين وتحليل البصمات من الكربوهيدرات في نهج واحد (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، فحص تستهدف السكريات التي تحتوي على السكريات النادرة مثل فوكوسي والأحماض uronic أو حتى السكريات غير معروفة لا يمكن أن يؤديها من خلال تحليل أحادي السكاريد تفصيلا. أيضا، تركيبات السكر مختلفة في نسب محددة يمكن الكشف عنها. وهذا يتيح تحديد بسيط من المتغيرات المرتبطة هيكليا من EPS معروفة أو EPS جديدة.
The authors have nothing to disclose.
We sincerely thank Thomas Howe and Jörg Carsten for the programming and technical support with the liquid handling systems.
96 well deep well plate 2.0 mL (DWP) | Greiner Bio-One | 780271 | Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990µl of ddH2O |
Breathable Sealing Film | Axygen | BF-400-S | Incubation film for pre- and main-culture DWP |
Aluminum Sealing Film | Axygen | PCR-AS-200 | -80 °C storage film for glycerol-stock plates |
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl | TECAN | 30038619 | Worktable position (WTP 2-1 to 2-4) |
A/B glass-filter-plate 1µm | Pall Corporation | PN 8031 | Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Greiner Bio-One | 651201 | Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well SpinColumn G-25 | Harvard Apparatus | 74-5612 | Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Nunc | 249944 | Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4) |
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips | TECAN | 30038609 | Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6) |
Trough 250 ml | Axygen | Res-SW96-HP | Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetat buffer pH 5.6 (CP 5-7) |
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) | Greiner Bio-One | 655101 | precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2) |
96-well silicon cap mat | Whatmann | 7704-0105 | Cover mat for MTP |
200 µl pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | For manually handling |
1000 µl pipette tips | Sarstedt | 70.762 | For manually handling |
96-well-PCR micro titer plate | Brand | 781350 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat | Brand | 781405 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
Filter plate 0.2 µm Supor, | Pall Corporation | PN 8019 | Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate |
Pipette Tips LHS 5-300 µl | Brand | 732150 | Brand LHS system |
ABTS (2.2-azino‑bis-(3‑ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid) | Sigma-Aldrich | A1888 | Glucose-assay |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | Glucose-assay |
Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Glucose-assay, pyruvat-assay |
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) | Wako Chemicals GmbH | 043-22351 | Pyruvat-assay |
Pyruvate oxidase | Sigma-Aldrich | P4591 | Pyruvat-assay |
Potassium phosphate dibasic | Carl-Roth | P749.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Potassium phosphate monobasic | Carl-Roth | 3904.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Pyruvat-assay |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 31413 | Pyruvat-assay |
2-Propanol | VWR | 20922.466 | Precipitation |
Phenol | VWR | 20599.231 | Phenol-sulfuric-acid method |
Sulfuric acid | Carl-Roth | 4623.4 | Phenol-sulfuric-acid method |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | Hydrolysis |
Ammonium solution | Carl-Roth | P093.1 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Phenol red | Alfa Aesar | B21710 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone | Sigma-Aldrich | M70800 | PMP-derivatization |
Methanol LC-MS | VWR | 83638.320 | PMP-derivatization |
Acetonitril LC-MS | VWR | 83040.320 | PMP-derivatization |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 338826 | PMP-derivatization, |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | PMP-derivatization |
Methyl red | Alfa Aesar | 36667 | pH-value |
Robotic liquid handling system | Tecan | Freedom EVO | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid handling station LHS | Brand | 709400 | Worktable setup in Figure 2 |
Tip-Adapter | Brand | 709434 | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid Ends MC 20-300µL | Brand | 709416 | Worktable setup in Figure 2 |
Adapter 60mm | Brand | 709430 | Worktable setup in Figure 2 |