We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.
Mange mikroorganismer er i stand til at producere og udskille exopolysaccharider (EPS), som har stor betydning i medicinske områder, fødevarer applikationer eller i udskiftning af petro-baserede kemikalier. Vi beskriver en analytisk platform, der skal automatiseres på en flydende håndteringssystem, der tillader hurtig og pålidelig analyse af typen og mængden af EPS produceret af mikroorganismer. Det gør det muligt for brugeren at identificere hidtil ukendte naturlige mikrobielle exopolysaccharid- producenter og analysere kulhydrat fingeraftryk af de tilsvarende polymerer indenfor en dag i high-throughput (HT). Ved hjælp af denne platform, kan stamme samlinger samt biblioteker af stamme-varianter, der kan opnås i tekniske tiltag screenes. Platformen har en modulær konfiguration, som tillader en adskillelse af protokollen i to hovedkategorier. Første er der et automatiseret screeningssystem, som kombinerer forskellige polysaccharid detektion moduler: en semi-kvantitativ analyse af viscosity-dannelse via centrifugering, en analyse af polymer dannelse via alkohol nedbør og bestemmelse af det samlede kulhydratindhold via en phenol-svovlsyre-syre transformation. Her er det muligt at screene op til 384 stammer pr løb. Anden del giver en detaljeret monosaccharid analyse for alle de udvalgte EPS producenter er identificeret i den første del ved at kombinere to vigtigste moduler: analysen af den fuldstændige monomersammensætning via ultra-højtryksvæskekromatografi koblet med ultraviolet og elektrosprayionisering ion trap ( UHPLC-UV-ESI-MS) og bestemmelse af pyruvat som en polymer substituent (tilstedeværelse af pyruvat ketal) via enzymatisk oxidation, der er koblet til en farvedannelse. Alle de analytiske modulerne i denne screening platform kan kombineres på forskellige måder og tilpasses individuelle behov. Derudover kan de alle håndteres manuelt eller udført med en håndteringssystem væske. Derved screeningen platform giver en enorm fleksibilitet for at identificere forskellige EPS.
Mikrobielle exopolysaccharider (EPS) er et strukturelt meget forskelligartet gruppe af polymerer, der opfylder forskellige biologiske funktioner. De normalt er bygget af komplekse gentagelsesenheder, der udmærker sig ved forskellige typer af monomerer (sukker, sukkerderivater, sukker syrer), bindingerne mellem disse monomerer og deres substitutioner. Den strukturelle mangfoldighed af mikrobielle polysaccharider giver temmelig forskellige karakteristika til medlemmerne af dette molekyle klasse, som giver deres anvendelse i forskellige områder som mad 1, kosmetik 2,3, byggeri kemi 4 eller vandbehandling 5. For yderligere at udvide området for anvendelsen af disse bio-baserede og sådanne bæredygtige polymerer identifikation af nye naturlige mikrobielle polysaccharider samt engineering af strukturelle varianter repræsenterer lovende tilgange. Uanset hvad, er en hurtig screeningsmetode forpligtet til hurtigt at scanne et utal af mikrobielle stammer til their polysaccharid dannelse, og analysere deres produkter. Derfor har vi for nylig udviklet en 96-brønds HT-screening platform til analyse af mikrobielle polysaccharid produktion fra naturlige isolater eller manipulerede stamme-varianter, der muliggør identificering af den monomere sammensætning 6.
Anvender dette platform for en første screeningsrunde på ~ 500 naturlige isolater tilladt os at identificere kun omkring 10 til 20% af de isolerede stammer som værende i stand til at producere EPS (data ikke vist). Det betyder, at 80-90% af de analyserede stammer ikke producerede EPS under de anvendte betingelser, og derfor en yderligere analyse af den detaljerede kulhydrat fingeraftryk ikke var nødvendigt. Da dette meget avancerede identifikation af den monomere sammensætning er en tidskrævende proces, især til dataanalyse, til en hurtig pre-screeningsmetode identificere de stammer, positive i EPS produktion, ville øge effektiviteten. Endvidere reagenser,hjælpematerialer og måling tid på UHPLC-UV-ESI-MS ville blive reduceret. Derudover forskellige analytiske moduler, mens det på den ene side gør fremgangsmåden yderst pålidelige, er på den anden side komplicere manuel håndtering af mere end to plader med 96 brønde i parallel, og som sådan begrænse det fulde potentiale af fremgangsmåden. Af disse årsager besluttede vi at udvikle en automatiseret screening platform. Derfor vi kombineret den modulære format af den eksisterende kulhydrat fingeraftryk teknik med en fuldt automatiseret hurtig påvisningsfremgangsmåde af det totale sukkerindhold, baseret på absorbansmålinger.
Phenol-svovlsyre-syre metode repræsenterer stadig den foretrukne metode til hurtig bestemmelse af det totale indhold af bakterielle og plante polysaccharider 7,8 kulhydrat. Denne metode blev først beskrevet af Dubois et al. 9 og tilpasset til forskellige anvendelser og prøvestørrelser, selv for små i 96-brønds plader 10,11. PHEnol-svovlsyre-syre metode måler det samlede kulhydratindhold med en værdi, summating alle monomere, oligomere og polymere carbonhydrater af prøverne.
Idet disse aspekter i betragtning, at valget af et egnet dyrkningsmedium er vigtigt at anvende denne metode. Komplekse medier indeholdende oligomere eller polymere kulhydrat forbindelser som gærekstrakt kan føre til en ændret polymer og derfor bør strengt undgås. Endvidere er store mængder af sukkerarter anvendes som C-kilde til dyrkning af stammerne. Høje niveauer af resterende kulhydrater fra dyrkning proces kan negativt interferere med målingen af EPS indhold.
Derfor er brugen af definerede og rene sukkerarter tilrådes. I vore eksperimenter anvendte vi glucose til dyrkning af cellerne. Den resterende glucose efter dyrkning blev reduceret via en gel-filtrering og bestemmes via en glucose-assay. Endelig glucose ækvivalents af polysacchariderne blev beregnet ved at subtrahere det resterende glucose efter gelfiltrering fra det samlede kulhydratindhold, der var blevet påvist med phenol-svovlsyre-syre metode. Gel-filtrering og glucose-assay i kombination med phenol-svovlsyre-syre metode sikrer pålidelige resultater og er i stand til at blive vores første, fuldstændig automatiseret detektionssystem.
To nye analytiske moduler indgik i den automatiserede screening platform for at øge mængden af information fra EPS-detektionssystem: udfældningen og observation af en stigning i viskositet.
Mange forskellige EPS – fx succinoglycan, xanthan og colon syre 12 – rapporteres at være modificeret med en ikke-kulhydrat pyruvat ketal på sukker positioner C4 og C6. Disse pyruvatforbindelser ketaler (ligesom succinyl halvestere og uronsyrer) bidrager til polyanioniske natur og derfor til det fysiske properties af polymeren ved at interagere via divalente kation broer 13. For at identificere disse særlige polymerer bestemmelse af pyruvat blev etableret som en anden ekstra analytisk modul. Dette øger de oplysninger om polysaccharid substituenter og deres potentielle makroskopiske egenskaber.
Kombinere alle moduler muliggør identifikation af forskellige EPS samt en hurtig og effektiv bestemmelse af EPS-producenter. Ved denne fremgangsmåde screening platform kan opdeles i to store dele (figur 1). Inden for den automatiserede screening (del I) arbejdsgangen sker fuldautomatisk (tabel 1) til hurtigt forudindstille EPS-producerende stammer. Carbohydrat fingeraftryk analyse (del II) kvantitativt bestemmer monomersammensætning af EPS produceret af de forudvalgte stammer. Derved blev dataanalyse minimeret for at optimere screening af store strain samlinger. Dennegiver mulighed for at analysere 384 stammer i en enkelt automatiseret screening løbe og med to kørsler, der er mulige per dag af 768 stammer per dag. Derudover kulhydrat fingeraftryk Analysen giver en endnu mere detaljeret oversigt over alle de identificerede EPS. Dette muliggør rettet analyse og identifikation af kun lidt forskellige EPS varianter eller helt nye forhold til de allerede beskrevne kemiske strukturer af EPS.
Polysaccharid detektion med phenol-svovlsyre-syre metode: Forskellige monosaccharider vise forskellige absorptionsmaksima og molære ekstinktionskoefficienter ved brug af denne metode 9. Dette resulterer i forskellige absorptionsmaksima af polymerer, som indeholder flere sukker i forskellige mængder. De forskellige bølgelængder af absorptionsmaksima for 16 forskellige kommercielt tilgængelige polymerer er givet i tabel 5. Polymererne blev opløst (1 g / l) i Hedeselskabet 2 O, omrørt (150 rpm) natten over og målt med phenol-svovlsyre-syre-metoden . Diutangummi viste den laveste absorptionsmaksima ved 470 nm og scleroglucan og hyaluronsyre det højeste ved 484 nm. Baseret på disse resultater 480 nm blev valgt til denne screening platform. Den relative absorbans af polymererne blev beregnet på basis af absorbansen opnået med 1 g / l glucose (sat til 100%). De laveste resultater blev opnået med scleroglucan og succinoglycan, begge med 92%. Dette var expected fordi scleroglucan kun indeholder glucose og succinoglycan indeholder glucose og galactose i forholdet 7: 1. Både kommercielle polymerer har forskellige tab af tørring og forskellige askeindhold, dette er grunden til den teoretiske værdi af ~ 110% ikke blev nået. Xylan viste den højeste relative absorbans med 311%. Årsagen til dette er den høje molære ekstinktionskoefficient opnået fra xylose grund af den dominerede furanoseform. På et niveau på 0,1 g / l glucose grænsen kvantificering blev nået, samt detektionsgrænsen ved en koncentration <0,05 g / l. Imidlertid detektionsgrænsen for positive stammer i screeningen er højere end 0,7 g / l, og derfor viste assayet en god præstation. For at få pålidelige resultater, blev den resterende glucose efter gelfiltrering bestemt med et glucose-assay, og denne værdi blev trukket fra den værdi fra phenol-svovlsyre-syre metode.
Automatiseret glucose-assay fortynding: Præstationenaf glucosen opgørelsen efter dyrkning (fortynding 1: 100) blev undersøgt. Til dette blev 10 pi supernatant overført til 990 pi Hedeselskabet 2 O i en dyb brønd plade og blandes via ti gange opsugning og dispensering 180 pi af denne fortynding. Det andet kritiske trin var den korrekte pipettering af kun 5 pi aliquot for 1:10 fortynding fra glucose-assayet efter gel-filtrering. For at generere fortyndingen 25 pi Hedeselskabet 2 O blev overført med en 50 pi-tip først blev bagefter 20 pi Hedeselskabet 2 O og 5 pi gel-filtrat aspireret sammen. Dette sikrer en bedre fjernelse af 5 pi aliquot ud af spidsen. Begge fortyndingstrin blev verificeret med forskellige glucose standarder via en glukose-assay. Resultaterne for to eksempelvise koncentrationer er anført i tabel 6 1:. 100 fortynding til bestemmelse af glucoseindholdet efter dyrkning viste høj præcision for begge standarder med en CV & #60; 1,2%. Samtidig, nøjagtigheden for højere standard var op til 11,6 (% fejl). Men dette er ubetydelig glucosen bestemmelse kun udgør den resterende glucoseindhold efter dyrkning og derfor er ikke vigtigt for polymeren detektion. Den 1:10 fortynding for de resterende glucose efter gelfiltrering viste meget pålidelige resultater med en CV <1,4% og en nøjagtighed <2,1% fejl.
Behandling af fordampning: Screeningen kræver 3,5 timer fra det første skridt til den første glukose-assay. For at finde ud af, om denne tidsramme har en indflydelse på reducerede MTP opbevaring blev 50 pi glucose-assay kalibreringsstandarder lagret med og uden låg i 3,5 timer i robotten karrusellen. I kalibreringen interval (45 til 4,5 mg / l) koncentrationen prøve næppe steget. En stigning – forårsaget af fordampning – var under 2,1%, og kun for de to laveste koncentrationer (1,8 og 0,9 mg / l) nåede op til 12,4% ( <strong> Tabel 7).
Gelfiltrering: Høje mængder af ikke-metaboliseret glucose forstyrrer kvantitativ påvisning af glucose fra den hydrolyserede polymer. Derfor blev en gel-filtreringstrin kræves for at fjerne det resterende glucose efter dyrkning. Derudover gelfiltrering renser polymer indeholdende supernatant fra salte og monomere kulhydrat forbindelser, andre end glucose, for at minimere den analytiske baggrund i monomeren analyse. Ved gel-filtreringstrin 35 pi filtrat blev anbragt i centrum af brønden. For validering af robustheden af gel-filtrering i det automatiserede system blev otte kalibreringsstandarder fra 0,045 op til 9 g / l glukose filtreres (n = 8). Glucosen af hver koncentration blev altid reduceret med mere end 95% af den oprindelige værdi (tabel 8). Herved viste gelfiltrering meget gode resultater for forskellige koncentrationer af glucose. Derudover resterende glucose efter gel-filtration blev også bestemt med en glucose-assay og trækkes fra den phenol-svovlsyre-syre vilje til at modtage den korrekte mængde glukose ækvivalent til den hydrolyserede polymer.
Pyruvat-assay: Først og fremmest blev det undersøgt, om den neutraliserede og fortyndet (1:10) TFA-matrix fra hydrolysetrinnet forstyrrer den enzymatiske reaktion. Derfor blev den komplette assay udført to gange, én gang med og én gang uden matrix og viste pålidelige resultater. Endelig blev pyruvatindhold af 16 kommercielt tilgængelige polymerer med held målt og er afbildet i figur 3. Det er almindeligt kendt, at ud af de 16 polymerer kun succinoglycan og xanthan naturligt indeholder pyruvat. Med vores pyruvat-assay begge disse polymerer blev korrekt identificeret. I scleroglucan, blev welangummi og xylan pyruvat også påvist i betydelige mængder. Samlet blev evne tilgang valideret og pyruvat-assay showed en høj ydeevne. Det viste sig at være i stand til at detektere pyruvat i forskellige polymerer efter hydrolyse.
Kulhydrat fingeraftryk: Efter at have udført alle analytiske moduler i automatiserede screening, blev potentielle EPS producenter udvalgt til kulhydrat fingeraftryk analyse. Til dette blev flere kriterier anvendt: 1) Positive observation af viskositet efter centrifugering og / eller efter filtrering. 2) Udfældning før og efter filtrering. Observerede fibre og flager blev evalueret som positive. 3) Glucose tilsvarende værdi fra phenol-svovlsyre-syre metode. Værdier> 700 mg / L blev bedømt som positive og værdier mellem 300 og 700 mg / l blev bedømt som formodede EPS producenter. Når to eller tre kriterier blev evalueret som positive, blev stammerne udvalgt til yderligere kulhydrat fingeraftryk analyse. Kriterierne kan tilpasses mod den enkelte formål med EPS screening (f.eks EPS lav viskositet). Vores tilgang til formål at finde efficient EPS-producenter. Når der søges efter stammer, der kun producerer små mængder af EPS bør reduceres evalueringen grænse af glucose tilsvarende.
Teknisk gavn og fremtidige applikationer: Et interessant træk ved denne protokol er den modulære karakter af trinene og de forskellige analytiske moduler. De kan kombineres på forskellige måder, justeret til individuelle behov og nye moduler kan nemt implementeres. Endvidere kan de analytiske moduler anvendes separat, fx hydrolysen modul i kombination med HT-PMP-derivatisering modul kan udføre en monomer analyse præparat fra forskellige polymeropløsninger (1 g / l) i 96-brønds format. For laboratorier uden at have adgang til et flydende håndteringssystem den komplette screening kan håndteres manuelt uden ændringer i pipettering ordningen. Men anvendelse af et væskehåndteringssystem øger, gennemløbet til op til 768 stammer (i stedet for 192 påvirkninger Hvis screened manuelt) per dag. Den protokol, der er beskrevet her er i stand til en screening for forskellige slægter og derfor til screening af store strain samlinger for at identificere hidtil ukendte EPS producenter og analysere deres kulhydrat fingeraftryk i én tilgang (figur 4). Endvidere kan en målrettet screening for polysaccharider indeholdende sjældne sukkerarter såsom fucose, uronsyrer eller endda ukendte sukre udføres via detaljerede monosaccharid analyse. Også, kan påvises forskellige sukker kombinationer i definerede nøgletal. Dette muliggør simpel identifikation af strukturelt beslægtede varianter af allerede kendte EPS eller nye EPS.
The authors have nothing to disclose.
We sincerely thank Thomas Howe and Jörg Carsten for the programming and technical support with the liquid handling systems.
96 well deep well plate 2.0 mL (DWP) | Greiner Bio-One | 780271 | Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990µl of ddH2O |
Breathable Sealing Film | Axygen | BF-400-S | Incubation film for pre- and main-culture DWP |
Aluminum Sealing Film | Axygen | PCR-AS-200 | -80 °C storage film for glycerol-stock plates |
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl | TECAN | 30038619 | Worktable position (WTP 2-1 to 2-4) |
A/B glass-filter-plate 1µm | Pall Corporation | PN 8031 | Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Greiner Bio-One | 651201 | Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well SpinColumn G-25 | Harvard Apparatus | 74-5612 | Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Nunc | 249944 | Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4) |
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips | TECAN | 30038609 | Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6) |
Trough 250 ml | Axygen | Res-SW96-HP | Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetat buffer pH 5.6 (CP 5-7) |
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) | Greiner Bio-One | 655101 | precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2) |
96-well silicon cap mat | Whatmann | 7704-0105 | Cover mat for MTP |
200 µl pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | For manually handling |
1000 µl pipette tips | Sarstedt | 70.762 | For manually handling |
96-well-PCR micro titer plate | Brand | 781350 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat | Brand | 781405 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
Filter plate 0.2 µm Supor, | Pall Corporation | PN 8019 | Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate |
Pipette Tips LHS 5-300 µl | Brand | 732150 | Brand LHS system |
ABTS (2.2-azino‑bis-(3‑ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid) | Sigma-Aldrich | A1888 | Glucose-assay |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | Glucose-assay |
Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Glucose-assay, pyruvat-assay |
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) | Wako Chemicals GmbH | 043-22351 | Pyruvat-assay |
Pyruvate oxidase | Sigma-Aldrich | P4591 | Pyruvat-assay |
Potassium phosphate dibasic | Carl-Roth | P749.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Potassium phosphate monobasic | Carl-Roth | 3904.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Pyruvat-assay |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 31413 | Pyruvat-assay |
2-Propanol | VWR | 20922.466 | Precipitation |
Phenol | VWR | 20599.231 | Phenol-sulfuric-acid method |
Sulfuric acid | Carl-Roth | 4623.4 | Phenol-sulfuric-acid method |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | Hydrolysis |
Ammonium solution | Carl-Roth | P093.1 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Phenol red | Alfa Aesar | B21710 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone | Sigma-Aldrich | M70800 | PMP-derivatization |
Methanol LC-MS | VWR | 83638.320 | PMP-derivatization |
Acetonitril LC-MS | VWR | 83040.320 | PMP-derivatization |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 338826 | PMP-derivatization, |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | PMP-derivatization |
Methyl red | Alfa Aesar | 36667 | pH-value |
Robotic liquid handling system | Tecan | Freedom EVO | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid handling station LHS | Brand | 709400 | Worktable setup in Figure 2 |
Tip-Adapter | Brand | 709434 | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid Ends MC 20-300µL | Brand | 709416 | Worktable setup in Figure 2 |
Adapter 60mm | Brand | 709430 | Worktable setup in Figure 2 |