We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.
Många mikroorganismer är kapabla att producera och utsöndra exopolysackarider (EPS), som har viktiga implikationer i medicinska områden, livsmedelsapplikationer eller i ersättning av oljebaserade kemikalier. Vi beskriver en analytisk plattform som skall automatiseras på ett vätskehanteringssystem som tillåter en snabb och tillförlitlig analys av den typ och den mängd EPS produceras av mikroorganismer. Det gör det möjligt för användaren att identifiera nya naturliga mikrobiella exopolysackarid tillverkare och analysera kolhydrat fingeravtryck av motsvarande polymerer inom en dag i hög genomströmning (HT). Med hjälp av denna plattform, kan stam samlingar samt bibliotek av stamvarianter som kan erhållas i tekniska metoder screenas. Plattformen har en modulär konfiguration, som tillåter en separation av protokollet i två huvuddelar. Första finns det en automatiserad screeningssystem, som kombinerar olika polysackarid detekteringsmoduler: en semikvantitativ analys av viscosity bildning via ett centrifugeringssteg, en analys av polymerbildning via alkoholutfällning och fastställandet av hela kolhydratinnehållet via en fenol-svavelsyra-syra transformation. Här är det möjligt att screena upp till 384 stammar per körning. Den andra delen ger en detaljerad monosackarid analys för alla valda EPS producenter som anges i den första delen genom att kombinera två viktiga moduler: en analys av hela monomerkompositionen via ultra-high performance vätskekromatografi i kombination med ultraviolett och elektro jonisering jonfälla detektering ( UHPLC-UV-ESI-MS) och bestämningen av pyruvat som en polymer substituent (närvaro av pyruvat ketal) via enzymatisk oxidation som är kopplad till en färgbildning. Alla analysmodulerna i detta screening-plattform kan kombineras på olika sätt och anpassas till individuella behov. Dessutom kan de alla hanteras manuellt eller utföras med en vätskehanteringssystem. Därigenom, screening platform möjliggör en stor flexibilitet för att identifiera olika EPS.
Mikrobiella exopolysackarider (EPS) är en strukturellt mycket skiftande grupp av polymerer som uppfyller olika biologiska funktioner. De brukar är byggda av komplexa upprepade enheter, som kännetecknas av olika typer av monomerer (socker, sockerderivat, sockersyror), banden mellan dessa monomerer och deras byten. Den strukturella mångfald av mikrobiella polysackarider ger ganska olika egenskaper till medlemmarna i denna molekyl klass, vilket gör att deras tillämpning i olika områden som livsmedel 1, kosmetika 2,3, byggkemi 4 eller vattenrening 5. För att ytterligare utvidga tillämpningsområdet för dessa biobaserade och sådana hållbara polymerer identifiering av nya naturliga mikrobiella polysackarider samt konstruktion av strukturella varianter representerar lovande metoder. Hursomhelst, är en snabb screeningmetod som krävs för att snabbt scanna ett stort antal mikrobiella stammar för their polysackarid bildning och att analysera deras produkter. Därför har vi nyligen utvecklat en 96-brunn HT-screening plattform för analys av mikrobiell polysackarid produktion från naturliga isolat eller konstruerade stamvarianter som omfattar identifiering av den monomera sammansättningen 6.
Att tillämpa denna plattform för en första screeningrunda ~ 500 naturliga isolat tillät oss att identifiera endast omkring 10 till 20% av de isolerade stammarna som kan producera EPS (data visas ej). Detta innebär att 80-90% av de analyserade stammarna inte producera EPS enligt de villkor som gäller, och därför inte var nödvändigt att göra en ytterligare analys av den detaljerade kolhydrat fingeravtryck. Eftersom detta mycket sofistikerad identifiering av den monomera sammansättningen är en tidskrävande process, särskilt för analys av data, till en snabb pre-screeningmetoden identifiera de stammar positiva i EPS-produktion, skulle drastiskt öka effektiviteten. Vidare reagenser,förbrukningsmaterial och mättid på UHPLC-UV-ESI-MS skulle minska. Dessutom, de olika analysmodulerna, medan på ena sidan göra metoden mycket tillförlitlig, är å andra sidan att komplicera manuell hantering av mer än två 96-brunnars plattor parallellt, och som sådan begränsar den fulla potentialen av metoden. Av dessa skäl beslutade vi att utveckla en automatiserad screening plattform. Därför kombinerade vi den modulära formatet för befintliga kolhydratfingeravtrycksteknik med en helautomatisk snabb detekteringsmetod av det totala sockerinnehållet, baserat på absorbans mätning.
Fenol-svavelsyra-syrametoden utgör fortfarande den viktigaste metoden för den snabba bestämningen av hela kolhydratinnehållet av bakterie- och växtpolysackarider 7,8. Denna metod beskrevs först av et al. Dubois 9 och anpassas för olika tillämpningar och provstorlekar, även för småskalig i 96-brunnsplattor 10,11. den phenol-svavelsyra-syrametoden mäter den totala kolhydrathalten genom ett värde, summerings alla monomera, oligomera och polymera kolhydrater av proverna.
Ta hänsyn till dessa aspekter, är viktigt att välja en lämplig odlingsmedium för att tillämpa denna metod. Komplexa media innehållande oligomera eller polymera kolhydratföreningar såsom jästextrakt kan leda till en förändrad polymerinnehåll och därför bör strikt undvikas. Vidare är höga mängder av sockerarter användas som C-källa för odling av stammarna. Höga nivåer av kvarvarande kolhydrater från odlingsprocessen kan negativt påverka mätningen av EPS innehåll.
Därför är användningen av definierade och rena sockerarter rekommenderas. I våra experiment har vi använt glukos för odling av cellerna. Den återstående glukos efter odling minskades via en gel-filtrering och bestäms via en glukosanalys. Slutligen, glukos motsvarandes av polysackariderna beräknades genom att subtrahera den kvarvarande glukos efter gel-filtrering från den totala kolhydratinnehållet som hade upptäckts med fenol-svavelsyra-syrametoden. Gel-filtrering och glukos-analys i kombination med fenol-svavelsyra-syrametoden garantera tillförlitliga resultat och kan vara vår första, helt automatiserad system för upptäckt.
Två nya analysmodulerna ingick i automatiserad screening plattform för att öka mängden information från systemet EPS-detektion: nederbörden och observation av en ökning i viskositet.
Många olika EPS – t.ex. succinoglykan, xantan och kolonsyra 12 – rapporteras ändras med en icke-kolhydrat pyruvat ketal socker positioner C4 och C6. Dessa pyruvat ketaler (precis som succinyl halvestrar och uronsyror) bidrar till polyanjoniska natur och därför den fysiska properties av polymeren genom att interagera via divalent katjon bryggor 13. För att identifiera dessa särskilda polymerer fastställandet av pyruvat bildades som en annan ytterligare analysmodul. Detta ökar information om polysackarid substituenter och deras potentiella makroskopiska egenskaper.
Kombinera alla moduler möjliggör identifiering av olika EPS samt en snabb och effektiv bestämning av EPS producenter. Genom detta tillvägagångssätt screening plattformen kunde delas in i två huvuddelar (Figur 1). Inom automatiserad screening (del I) arbetsflödet sker helautomatisk (tabell 1) för att snabbt förvälja EPS stammar. Kolhydrat fingeravtryck analys (del II) bestämmer kvantitativt monomerkompositionen av EPS som produceras av de förvalda stammar. Därigenom var dataanalysen minimeras för att optimera screening av stora stam samlingar. Dettaerbjuder möjligheten att analysera 384 stammar i en enda automatiserad screeningskörning och med två körningar som möjligt per dag av 768 stammar per dag. Dessutom ger kolhydratfingeravtrycksanalysen en ännu mer detaljerad översikt över alla identifierade EPS. Detta möjliggör den riktade analys och identifiering av endast något olika EPS-varianter eller helt nya jämfört med de redan beskrivna kemiska strukturerna av EPS.
Polysackarid detektion med fenol-svavelsyra-syrametoden: Olika monosackarider visar olika absorptionsmaxima och molar extinktionskoefficienter med hjälp av denna metod 9. Detta resulterar i olika absorptionsmaxima av polymerer, som innehåller flera socker i olika mängder. De olika våglängder av absorptionsmaxima för 16 olika kommersiellt tillgängliga polymerer ges i Tabell 5. Polymerema löstes (1 g / L) i DDH 2 O, omrördes (150 rpm) över natten och mättes med fenol-svavelsyra-syra-metod . Diutangummi visade lägsta absorptionsmaxima vid 470 nm och skleroglukan och hyaluronsyra den högsta på 484 nm. Baserat på dessa resultat 480 nm valdes för denna screening plattform. Den relativa absorbansen för polymererna beräknades baserat på absorbans som erhölls med 1 g / L glukos (satt som 100%). De lägsta resultat erhölls med skleroglukan och succinoglykan, båda med 92%. Detta var expected eftersom skleroglukan endast innehåller glukos och succinoglykan innehåller glukos och galaktos i ett förhållande av 7: 1. Både kommersiella polymerer har olika förluster av torkning och olika askhalt, är detta anledningen till att det teoretiska värdet på ~ 110% inte nåddes. Xylan visade den högsta relativa absorbansen med 311%. Anledningen till detta är den höga molära extinktionskoefficienten uppnås från xylos på grund av den furanos mer dominerande formen. Vid en nivå av 0,1 g / L glukos kvantifieringsgränsen nåtts, såväl som detektionsgränsen vid en koncentration <0,05 g / L. Emellertid är gränsen för positiva stammar i screening upptäckt högre än 0,7 g / L och därför analysen visade ett bra resultat. För att få tillförlitliga resultat, var den kvarvarande glukos efter gelfiltrering bestämdes med en glukos-analysen och detta värde subtraherades från värdet från fenol-svavelsyra-syrametoden.
Automatiserad glukos-assay utspädning: Föreställningenav glukosbestämning efter odling (spädning 1: 100) undersöktes. För detta var 10 pl supernatant överfördes till 990 | il DDH 2 O i en djup brunnar och blandas via tio gånger aspire och dispense 180 ul av denna utspädning. Det andra kritiska steget var den korrekta pipettering av endast 5 | j, l alikvot för 1:10 utspädning från den glukos-analysen efter gelfiltrering. För att generera utspädningen 25 | il av DDH 2 O överfördes med en 50 ^ il-spetsen först, var efteråt 20 | il av DDH 2 O och 5 | j, l gel-filtrat aspireras tillsammans. Detta säkerställer en bättre avlägsnande av 5 | j, l alikvot av spetsen. Båda spädningssteg verifierades med olika glukosstandarder via en glukosanalys. Resultaten för två exempel på koncentrationer ges i tabell 6. 1: 100 utspädning för bestämning av glukoshalten efter odling visade hög precision för båda standarderna med CV & #60; 1,2%. Samtidigt, var noggrannheten för högre standard upp till 11,6 (% fel). Detta är dock försumbar eftersom glukosbestämning representerar endast den återstående glukoshalten efter odling och därför är inte viktigt för polymeren detektering. 1:10 utspädning för kvarvarande glukos efter gel-filtrering visade mycket tillförlitliga resultat med ett CV <1,4% och en noggrannhet <2.1% fel.
Behandling av avdunstning: Screeningen kräver 3,5 timmar från det första steget till den första glukos-analysen. För att ta reda på, om denna tidsram har en påverkan på icke-begränsade MTP lagring, var 50 pl glukosanalyskalibreringsstandarder lagras med och utan lock under 3,5 timmar i robot karusellen. I kalibreringsintervallet (45 till 4,5 mg / L) provkoncentrationen knappast ökat. En ökning – orsakad av avdunstning – var under 2,1% och endast för de två lägsta koncentrationer (1,8 och 0,9 mg / L) nådde upp till 12,4% ( <strong> Tabell 7).
Gelfiltrering: Höga halter av icke-metaboliseras glukos stör kvantitativ detektion av glukos från den hydrolyserade polymeren. Därför framställdes en gel-filtreringssteg krävs för att avlägsna kvarvarande glukos efter odling. Dessutom renar gelfiltrering polymeren innehållande supernatanten från salter och monomera kolhydratföreningar, andra än glukos, för att minimera den analytiska bakgrund i analysen monomeren. Vid gel-filtreringssteget 35 pl av filtratet placerades i mitten av brunnen. För validering av robustheten gel-filtrering i det automatiserade systemet, åtta kalibreringsstandarder från 0,045 upp till 9 g / L glukos filtreras (n = 8). Glukos av varje koncentration var alltid minskat med mer än 95% av det ursprungliga värdet (tabell 8). I att göra så, gel-filtrering visade mycket goda resultat för olika koncentrationer av glukos. Dessutom, den kvarvarande glukos efter gel-filtration bestämdes också med en glukos-assay och subtraheras från fenol-svavelsyra-syra bestämningen att få rätt mängd glukos motsvarande för den hydrolyserade polymeren.
Pyruvat-analys: Först av allt, var det undersökte huruvida den neutraliserade och utspädda (1:10) TFA-matris från hydrolyssteget stör den enzymatiska reaktionen. Därför var den kompletta assay utfördes två gånger, en gång med och en gång utan matris och visade tillförlitliga resultat. Slutligen är innehållet av 16 kommersiellt tillgängliga polymerer pyruvat lyckades uppmättes och är avbildad i fig 3. Det är allmänt känt att av dessa 16 polymerer endast succinoglykan och xantan naturligt innehålla pyruvat. Med vår pyruvat-analysen båda dessa polymerer identifieras. I skleroglukan var welangummi och xylan pyruvat detekterades också i betydande mängder. Sammantaget var förmågan hos metoden valideras och pyruvat-analysen showed en hög prestanda. Det visade sig kunna detektera pyruvat i olika polymerer efter hydrolys.
Kolhydrater fingeravtryck: Efter att ha utfört samtliga analysmoduler i automatiserad screening, var potentiella EPS producenter ut för kolhydratfingeravtrycksanalys. För detta har flera kriterier tillämpas: 1) Positiva observation av viskositeten efter centrifugering och / eller efter filtrering. 2) Utfällning före och efter filtrering. Observerade fibrer och flingor utvärderades som positiva. 3) Glukos motsvarande värde från fenol-svavelsyra-syrametoden. Värden> 700 mg / L bedömdes som positiv och värden mellan 300 och 700 mg / L bedömdes som förmodade EPS producenter. När två eller tre kriterier utvärderades som positiva, var stammarna ut för ytterligare kolhydratfingeravtrycksanalys. Kriterierna kan anpassas till den enskilde syftet med EPS screening (t.ex. låg viskositet EPS). Vår strategi syftar till att finna efficient EPS producenter. När man söker efter stammar som endast producerar små mängder av EPS utvärderingen gränsen för glukos ekvivalent bör minskas.
Teknisk fördel och framtida tillämpningar: En intressant egenskap hos detta protokoll är modul karaktär av stegen och de olika analysmodulerna. De kan kombineras på olika sätt, justerat till individuella krav och nya moduler kan lätt genomföras. Vidare kan de analysmodulerna användas separat, till exempel hydrolys modulen i kombination med HT-PMP-derivatisering modul är i stånd att utföra en monomer kompositionsanalys från olika polymerlösningar (1 g / L) i 96-brunnsformat. För laboratorier utan att ha tillgång till ett vätskesystem hanterings den kompletta screening kan hanteras manuellt utan några förändringar i pipetteringssystemet. Men med hjälp av ett vätskehanteringssystem ökar genomströmningen upp till 768 stammar (i stället för 192 stammar förekommande screened manuellt) per dag. Protokollet som beskrivs här är i stånd att en screening för olika släkten och därmed för screening av stora stam samlingar för att identifiera nya EPS producenter och analysera deras kolhydrat fingeravtryck i en strategi (Figur 4). Dessutom kan en riktad screening för polysackarider innehållande sällsynta socker som fukos, uronsyror eller även okända socker utföras via detaljerad monosackarid analys. Dessutom kan olika sockerkombinationer i definierade förhållanden detekteras. Detta gör det möjligt att enkelt identifiera strukturellt besläktade varianter av redan kända EPS eller nya EPS.
The authors have nothing to disclose.
We sincerely thank Thomas Howe and Jörg Carsten for the programming and technical support with the liquid handling systems.
96 well deep well plate 2.0 mL (DWP) | Greiner Bio-One | 780271 | Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990µl of ddH2O |
Breathable Sealing Film | Axygen | BF-400-S | Incubation film for pre- and main-culture DWP |
Aluminum Sealing Film | Axygen | PCR-AS-200 | -80 °C storage film for glycerol-stock plates |
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl | TECAN | 30038619 | Worktable position (WTP 2-1 to 2-4) |
A/B glass-filter-plate 1µm | Pall Corporation | PN 8031 | Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Greiner Bio-One | 651201 | Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well SpinColumn G-25 | Harvard Apparatus | 74-5612 | Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Nunc | 249944 | Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4) |
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips | TECAN | 30038609 | Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6) |
Trough 250 ml | Axygen | Res-SW96-HP | Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetat buffer pH 5.6 (CP 5-7) |
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) | Greiner Bio-One | 655101 | precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2) |
96-well silicon cap mat | Whatmann | 7704-0105 | Cover mat for MTP |
200 µl pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | For manually handling |
1000 µl pipette tips | Sarstedt | 70.762 | For manually handling |
96-well-PCR micro titer plate | Brand | 781350 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat | Brand | 781405 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
Filter plate 0.2 µm Supor, | Pall Corporation | PN 8019 | Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate |
Pipette Tips LHS 5-300 µl | Brand | 732150 | Brand LHS system |
ABTS (2.2-azino‑bis-(3‑ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid) | Sigma-Aldrich | A1888 | Glucose-assay |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | Glucose-assay |
Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Glucose-assay, pyruvat-assay |
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) | Wako Chemicals GmbH | 043-22351 | Pyruvat-assay |
Pyruvate oxidase | Sigma-Aldrich | P4591 | Pyruvat-assay |
Potassium phosphate dibasic | Carl-Roth | P749.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Potassium phosphate monobasic | Carl-Roth | 3904.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Pyruvat-assay |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 31413 | Pyruvat-assay |
2-Propanol | VWR | 20922.466 | Precipitation |
Phenol | VWR | 20599.231 | Phenol-sulfuric-acid method |
Sulfuric acid | Carl-Roth | 4623.4 | Phenol-sulfuric-acid method |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | Hydrolysis |
Ammonium solution | Carl-Roth | P093.1 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Phenol red | Alfa Aesar | B21710 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone | Sigma-Aldrich | M70800 | PMP-derivatization |
Methanol LC-MS | VWR | 83638.320 | PMP-derivatization |
Acetonitril LC-MS | VWR | 83040.320 | PMP-derivatization |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 338826 | PMP-derivatization, |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | PMP-derivatization |
Methyl red | Alfa Aesar | 36667 | pH-value |
Robotic liquid handling system | Tecan | Freedom EVO | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid handling station LHS | Brand | 709400 | Worktable setup in Figure 2 |
Tip-Adapter | Brand | 709434 | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid Ends MC 20-300µL | Brand | 709416 | Worktable setup in Figure 2 |
Adapter 60mm | Brand | 709430 | Worktable setup in Figure 2 |