Ex Vivo Intestinal Sacs para Avaliar mucosa Permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal

Summary

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

Abstract

A barreira epitelial é a primeira defesa inata do tracto gastrointestinal e regula selectivamente o transporte a partir do lúmen para os compartimentos dos tecidos subjacentes, restringir o transporte de moléculas pequenas através do epitélio e quase completamente proibindo transporte macromolecular epitelial. Esta selectividade é determinada pela camada de gel mucosa, o que limita o transporte de moléculas lipofílicas e ambos os receptores apicais e complexos de proteína de junções apertadas do epitélio. Modelos in vitro de cultura de células de epitélio são convenientes, mas como um modelo, falta-lhes a complexidade das interacções entre a microbiota, muco-gel, epitélio e sistema imunológico. Por outro lado, a avaliação in vivo da absorção intestinal ou da permeabilidade pode ser realizada, mas estes ensaios medem a absorção gastrointestinal, em geral, sem qualquer indicação de especificidade local. Ex vivo ensaios de permeabilidade intestinal usando "sacos"; são um método rápido e sensível de medir tanto a integridade intestinal global comparativa ou transporte de uma molécula específica, com a vantagem adicional de especificidade local intestinal. Aqui descreve-se a preparação de sacos para os estudos de permeabilidade intestinal e o cálculo da permeabilidade aparente _{(P app)} de uma molécula através da barreira intestinal. Esta técnica pode ser usada como um método de avaliar a absorção do fármaco, ou para analisar a disfunção da barreira epitelial regional nos modelos animais de doenças gastrointestinais.

Introduction

A barreira epitelial intestinal do tracto gastrointestinal é uma área de superfície de mucosa estimado em cerca de 400 m ² no adulto humano. Consequentemente, é constantemente expostos a desafiar de micróbios, drogas ingeridas, nutrientes e toxinas bacterianas. O hospedeiro deve não só distinguir entre bactérias comensais toleráveis ​​e os potenciais agentes patogénicos, mas deve evitar que estas espécies e as suas moléculas segregadas a partir de atravessar a barreira epitelial, enquanto, ao mesmo tempo que permite a absorção de nutrientes. Assim, o papel do epitélio intestinal é actuar como uma barreira selectiva para o conteúdo luminal ^1. Isto é conseguido, em parte, pelo sistema de defesa inata epiteliais na mucosa, que actua através de um sistema biológico responsivo que consiste em mecanismos constitutivos e indutíveis ^2.

A perda da função de barreira epitelial é uma patologia que é característico de um número de doenças gastrointestinais. In vivoexame da função de barreira epitelial podem ser avaliados através de gavagem oral de uma molécula de marcador e a análise subsequente de soro ^3. No entanto, esta técnica não oferece nenhuma indicação quanto ao local da disfunção da barreira. In vitro e avaliação ex vivo da resistência transepitelial usando sistemas Transwell ³ e câmaras de Ussing ^4,5, respectivamente, são comumente utilizados como marcadores substitutos da função barreira epitelial, mas falta a fisiologia da doença contribuindo de modelos animais ^6. Neste protocolo, descrevem um modelo de preparação de tecido ex vivo que permite a avaliação directa e localizada de integridade intestinal e que pode ser utilizada para avaliar a função de barreira da mucosa a um número de níveis. Mais importante, esta técnica pode ser aplicada aos modelos animais de doença, ou podem ser manipulados para permitir farmacologicamente interrogação em profundidade de uma disfunção da barreira da mucosa.

Protocol

Todo o trabalho de animais neste protocolo é realizada com a estrita observância Universidade do Comitê de Ética Newcastle animal procedimentos aprovados. 1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura e pratos Pré-quente Mídia 199 (TC199) ou de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) media a 37 ° C. Pré-oxigenar o meio por borbulhamento com 95% de O2 / 5% de CO 2. Verificar que a forma tem um pH final de 7,3. Prepare sutura co…

Representative Results

Este protocolo pode ser usado para examinar as mudanças regionais na função de barreira intestinal em modelos animais da doença gastrointestinal. Através da medição do fluxo de uma sonda paracelular através da superfície da mucosa em zonas diferentes do tracto gastrointestinal 7, a integridade das junções apertadas epiteliais pode ser avaliada. Além disso, fazendo variar a natureza da sonda paracelular por tamanho (Figura 2) ou a hidrofobicidade <s…

Discussion

Aqui, nós detalhou o isolamento e preparação de sacos intestinais para avaliar a função barreira da mucosa ex vivo. sac preparações intestinais têm sido principalmente utilizados em investigação farmacêutica, examinando a absorção de medicamentos candidatos em todo o intestino. No entanto, este ensaio é igualmente adequado para o estudo da doença intestinal. permeabilidade intestinal podem variar muito por região e local de avaliação específica da permeabilidade permite uma melhor compreensã…

Materials

Dekantel  Non-absorbable Silk suture	Braintree Scientific	SUT-S 116
Media 199 (TC199)	Life Technologies	11043-023	No phenol red as this interferes with fluorescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	21063-045	No phenol red as this interferes with fluorescence
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich		Use at 10mM in media
Small animal vascular cathether: Physiocath	Data Sciences International	277-1-002
FITC-Dextran 4400 MW	Sigma Aldrich	FD-4
FITC-Dextran 20,000 MW	Sigma Aldrich	FD-20
FITC-Dextran 70,000 MW	Sigma Aldrich	FD-70