마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
급속 자극시 사이토 카인을 분비하는 능력은 불변성 자연 살해 T (하여 iNKT) 세포 계보의 기능적 특성이다. 하여 iNKT 세포 따라서 면역 반응을 활성화시키고 스티어링 적응 가능한 타고난 T 세포군으로 특징 지어진다. 뮤린하여 iNKT 세포의 배양 및 확장을위한 개선 된 기술의 개발은 시험 관내 및 생체 내 모델 시스템 인 iNKT 세포 생물학 연구를 용이하게한다. 여기에서 우리는 고립과 쥐의 비장하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 된 절차를 설명합니다.
C57BL / 6 마우스로부터 비장을 제거하고 해부 변형하고, 생성 된 세포 현탁액을 밀도 구배 매체를 통해 적층된다. 원심 분리 후, 비장 단핵 세포 (다국적)를 수집 및 CD5 양성 (CD5 +) 림프구는 자성 비드를 사용하는 농축된다. CD5 + 분획 내의하여 iNKT 세포는 계속해서 ^ 묻5; CD1d 테트라을 GalCer는로드 및 형광 활성 세포 정렬 (FACS)로 정제. FACS는 뮤린 재조합 IL-7의 존재 하에서 확장되기 전에, 재조합 쥐 사이토 플레이트 – 결합 T 세포 수용체 (TCR) 자극의 조합을 사용하여 iNKT 세포는 처음에 다음 체외 배양 정렬. 약 108 인 iNKT 세포들은 시험 관내 기능 분석을위한, 또는 마우스 생체 내 전달 실험에 사용할 수있는 배양 후 18-20 일 내에 발생 될 수있는이 기술을 사용.
Introduction
쥐 불변 자연 살해 T (인 iNKT) 세포는 CD1d 발현 대뇌 피질의 흉선 세포 1, 2에 의해 흉선에서 선택한 타고난 T 림프구의 뚜렷한 인구입니다. 하여 iNKT 세포 Vβ8, Vβ7 또는 CD1d의 컨텍스트에서 내인성뿐만 아니라 외국인 지질 항원을 인식 할 수있다 Vβ2 TCR도 3 중 하나와 짝을 불변 Vα14-Jα18 TCR 사슬로 구성된 T 세포 수용체 (TCR)를 표현한다. 예를 들어, 뮤린하여 iNKT 세포를 인식하고 내인성 지질 항원이라는 isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4뿐만 아니라, α – 갈 락토 실 (αGalCer) 5,6- 해양 해면에서 분리 된 당지질에 의해 활성화된다. TCR은 종속 <하여 iNKT 세포의 활성화는 적응성 면역 반응의 프라이밍을 조장하고, 결과적으로하여 iNKT 세포는 류마티스 성 질환 (7)와 암을 포함하여 병변의 범위의 경감 또는 개발에 기능적으로 관여하는 것으로 밝혀졌다SUP> 8. 현재, 합성하여 iNKT 세포 리간드는 immunopathological 다수의 조건을 조절 할 수있다 유망한 새로운 백신 보조제를 구성한다.
이것은 이전하여 iNKT 세포 그러나 마우스 조직으로부터 분리 다음 시험 관내에서 생성 될 수 있음을 입증되었다; 이러한 연구의 많은 주요 항원 제시 세포 (APC를) 및 / 또는 세포주 (9)의 사용을 채택 Vα14 TCR 트랜스 제닉 (Tg)가 인 iNKT 세포 유래 하이 브리 도마 (11, 12)의 생성을위한 마우스 (10), 또는 흉선종. 또한, 마우스의 큰 숫자는 같은 αGalCer로드 CD1d 이량 체, 및 긴 배양 배 시약의 높은 볼륨이 일부 공개 프로토콜 덜 윤리적, 경제적으로 9, 13을 호소합니다.
이 보고서에서 우리는 고립과 마우스의 비장에서하여 iNKT 세포의 체외 확장에 적응하는 방법을 설명합니다. 구체적으로는, 프로토콜이 방법을 기술FACS 셀 소팅에 필요한 마우스, 시약 및 시간을 감소시키고, 비장 체외로 정렬하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 방식이 제안 마우스 비장하여 iNKT 세포를 풍부하게.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 프로토콜의 중요한 단계는 분리 및 CD5 + 림프구 (제 1 & 2)의 후속 농축, FACS 정렬 (섹션 3)하여 iNKT 세포의 초기 도금 (4 절)를 포함한다. 섹션 1에서 수행 된 단계 신중 별개 셀룰러 상간 원심 다음 생성되도록 밀도 구배 매질을 통해 비장 세포 현탁액을 층에 기억한다. 자기 세포 분리 (제 2 항)에 의해 CD5 + 림프구의 후속 농축은 얼룩에 필요한 시약 및 시간을 최소화 및 증가하…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
Referências
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