Een snelle en kwantitatieve Fluorimetrische Methode voor-eiwit targeting Small Molecule drugscontrole
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
We laten een nieuw geneesmiddel screening methode voor het bepalen van de bindingsaffiniteit van kleine geneesmiddelmoleculen met een doeleiwit door de vorming van fluorescerende nanoclusters goud (Au NC) in de met geneesmiddel beladen eiwitten, gebaseerd op de differentiële fluorescentiesignaal uitgestraald door de Au NC's. Albumine eiwitten zoals humaan serumalbumine (HSA) en runderserumalbumine (BSA) gekozen als model eiwitten. Vier kleine moleculaire geneesmiddelen (bijvoorbeeld ibuprofen, warfarine, fenytoïne en sulfanilamide) van verschillende bindingsaffiniteiten aan het albumine-eiwitten worden getest. Gevonden werd dat de vormingssnelheid van fluorescente Au NC binnen het geneesmiddel geladen albumine-eiwit onder denaturerende omstandigheden (dat wil zeggen 60 ° C of in aanwezigheid van ureum) is trager dan dat gevormd in het oorspronkelijke eiwit (zonder geneesmiddelen). Bovendien wordt de fluorescentie-intensiteit van de zo gevormde NC gevonden invers gecorreleerd aan de bindingsaffiniteiten van deze geneesmiddelen aan de albumine-eiwitten. Bijzonder,hoe hoger de drug-proteïne-bindingsaffiniteit, hoe langzamer de snelheid van Au NC vorming, en dus een lagere fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NC's waargenomen. De fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NCs verschaft derhalve een eenvoudige maat voor de relatieve sterkte van binding verschillende geneesmiddelen getest. Deze methode is ook uit te breiden tot het specifieke geneesmiddel-eiwitbinding constante (KD) te meten door eenvoudigweg variëren van de hoeveelheid geneesmiddel voorgeladen in het eiwit op een vaste eiwitconcentratie. De gemeten resultaten goed overeenkomen met de verkregen met behulp van andere prestige maar ingewikkelder methoden waarden.
Introduction
Serum albuminen zoals menselijk serumalbumine (HSA) en runderserumalbumine (BSA) zijn de meest voorkomende eiwitten in plasma en speelt een essentiële rol bij het handhaven van de osmotische druk van het bloedcompartiment. Ze zijn ook bekend als dragereiwitten voor kleine moleculen met lage oplosbaarheid in water, zoals steroïden, vetzuren, schildklierhormonen en diverse geneesmiddelen. De bindingseigenschap (bijvoorbeeld bindingsplaatsen, bindingsaffiniteit of sterkte) van deze moleculen serum albumine een belangrijk onderwerp farmacokinetiek. 1-4 verschillende analysemethoden zijn ontwikkeld voor de studie van de bindingseigenschappen van verschillende geneesmiddelen op albuminen serum, zoals röntgenkristallografie 5,6 kernspinresonantie (NMR), 11/07 en surface plasmon resonance (SPR), 12,13 etc. Echter, deze werkwijzen beperkt door ofwel een vervelend en tijdrovend analyseproces (bijvoorbeeld groei van éénkristal röntgen- Crystallografisch onderzoek), vereiste gespecialiseerde en dure apparatuur (SPR), of behoefte aan dure isotopen (NMR) voor detectie. Het is derhalve zeer gewenst om alternatieve manieren om kleine moleculaire drugonderzoek ontwikkelen snel, straight-forward en kostenefficiënte wijze.
Nanoclusters goud (Au NC's) zijn een speciaal type nanomateriaal, waarvan enkele tot tientallen metaalatomen met afmetingen kleiner dan 2 nm. 14-17 Zij hebben uitgebreid onderzoek belangen aangetrokken bevatten vanwege hun discrete en grootte-afhankelijke elektronische structuur, 18, 19 en moleculair-achtige absorpties en emissies. 20-23 Deze unieke materiaaleigenschappen, in het bijzonder de sterke fluorescentie, hebben diverse toepassingen zoals detectie en beeldvorming in biologische systemen. 24-32 Ultrakleine fluorescent Au NC's kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van functionele eiwitten, zoals serumalbuminen, als matrijs. 33 In een typische eiwit templated synthese van Au NCs worden een zekere Au zouten eerst ingekapseld binnen het eiwit en vervolgens gereduceerd door het eiwit zelf. Het reducerende vermogen van het eiwit wordt toegeschreven aan functionele aminozuurresiduen (bijvoorbeeld tyrosine) die kunnen worden geactiveerd door verhoging van de pH van de oplossing alkalisch samenstellende. Ontvouwen van eiwitstructuur wordt beschouwd als een kritische stap voor de vorming van Au NC. Dit komt omdat in een ongevouwen eiwit kan verminderen meer functionele groepen worden blootgesteld aan de ingekapselde Au zouten. Eiwitontvouwende kan worden verkregen door warmtebehandeling of blootstelling aan denaturerende agentia. Introductie van kleine moleculaire geneesmiddelen kan ook invloed hebben op de ontplooiing, dwz het modificeren van het middelpunt denaturatietemperatuur en de enthalpie van ontvouwen. 34,35 Het effect van al deze factoren, op zijn beurt kan worden weerspiegeld door de vorming kinetiek van fluorescerende Au NC en gemanifesteerd in de fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NC. 36
e_content "> Deze video toont de werkwijze het screenen van geneesmiddelen door het synthetiseren Au NC's in met geneesmiddel beladen albumine-eiwitten bij een hogere temperatuur (60 ° C) of in de aanwezigheid van denaturerende middelen (bijvoorbeeld ureum). De fluorescentie-intensiteit van de overblijvende Au NC is het signaal uitlezing. Eerst Au NC gesynthetiseerd in HSA en BSA templates behandeld bij 60 ° C of in aanwezigheid van ureum aan hoe eiwitontvouwende (geïnduceerd door hittebehandeling of denatureringsmiddelen) beïnvloedt de vorming kinetiek van Au NC's. Ten tweede, Au NC worden gesynthetiseerd eiwit templates voorgeladen met andere geneesmiddelen en de geneesmiddelbelading effect op de relatieve fluorescentie-intensiteiten van de overblijvende Au NC bestudeerd, waarbij de mate van relatieve binding sterkte. Tenslotte wordt het au NC-drug discovery protocol gemodificeerd kwantitatieve meting van drug-proteïne-bindingsconstante (K D) door het variëren van de hoeveelheid geneesmiddel voorgeladen in het eiwit van een vaste concentratie.Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen die moeten worden benadrukt in deze werkwijze. In het protocol van het screenen van de relatieve bindingsaffiniteit van verschillende kleine moleculaire geneesmiddelen, stappen 3.1.2, 3.1.3 en 3.1.4 zijn van cruciaal belang om goede resultaten te tonen consistente trend voor de relatieve bindende kracht te verkrijgen. In deze stappen, moet het optreden van toevoeging van chemicaliën en tekenen reactieoplossingen voor meting zo snel mogelijk op de tijdspanne effect en dezelfde vol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
Referências
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -. L., Carrupt, P. -. A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. . Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -. e. The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. . Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , (2010).
