Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
Biz Au NC'ler tarafından yayılan farklı flüoresans sinyaline dayalı ilaç yüklü protein içinde flüoresan altın nanoyığınlar (Au NCS) oluşturan bir hedef proteine, küçük ilaç moleküllerinin bağlanma afinitesini belirlemek için yeni bir ilaç tarama yöntemi göstermektedir. Insan serum albümini (HSA) ve sığır serum albümini (BSA) gibi albümin proteinleri modeli proteinler olarak seçilir. Dört adet küçük molekül ilaç albümin proteinleri, farklı bağlanma afiniteleri (ör ibuprofen, varfarin, fenitoin ve sülfanilamid) test edilir. Bu denatüre edici koşullar (örneğin, 60 ° C veya üre varlığında) altındaki ilaç yüklü albumin protein içindeki fluoresan Au NC'ler oluşumu oranı (ilaç olmadan) bozulmamış proteininde oluşmuş daha yavaş olduğu bulunmuştur. Dahası, şekillendirilmiş NC'ler floresan yoğunluğu ile ters albümin proteinleri bu ilaçların bağlanma ilgisi ilişkili olduğu bulunmuştur. Özel olarak,Au NC'ler oluşum hızı daha yavaş ilaç-protein bağlanma afinitesi daha yüksektir ve bu şekilde elde edilen Au NC'ler daha düşük bir floresans yoğunluğu görülmektedir. Elde edilen Au NC'ler floresan yoğunluğu dolayısıyla test farklı ilaçların göreceli bağlanma gücü basit bir ölçümünü sağlar. Bu yöntem aynı zamanda, sadece sabit bir protein konsantrasyonunda protein yüklenmiş ilaç içeriğini değiştirerek spesifik ilaç-protein bağlayıcı sabiti (KD) ölçmek üzere genişletilebilir. Ölçülen sonuçlar, diğer itibar ama daha karmaşık yöntemler kullanılarak elde edilen değerlerle iyi uyum sağlar.
Introduction
Insan serum albümini (HSA) ve sığır serum albümini (BSA) gibi serum albüminler, plazmada en fazla protein vardır ve kan bölmesi osmotik basıncının sağlanmasında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca, steroidler gibi, suda düşük çözünürlüklü, küçük moleküller, yağ asitleri, tiroid hormonları ve ilaçlar çok çeşitli taşıyıcı proteinler olarak kabul edilmektedir. Bağlama özelliği albüminler serum, bu moleküllerin (örneğin, afinite ya da bağlanma kuvvetinin, bağlanma yerleri) farmakokinetik önemli bir konu teşkil etmektedir. 1-4 Çeşitli analitik yöntemler gibi albüminler serum farklı ilaçların bağlanma özelliklerini incelemek için geliştirilmiştir X-ışını kristalografisi, 5,6 nükleer manyetik rezonans (NMR), 7-11 ve yüzey plazmon rezonans (SPR), 12,13 vs. Bununla birlikte, bu yöntemler, bir sıkıcı ve zaman alıcı bir analiz işlemi (ya da tarafından kısıtlanır, örneğin, X-ışını Crystallo tek kristal büyümeGrafik çalışması), özel ve pahalı ekipman gerekliliği (SPR), veya tespiti için pahalı izotop etiketleme (NMR) muhtaç. Bu, hızlı bir düz ileri ve maliyet-etkin bir şekilde, küçük molekül ilaç taraması için alternatif yollar oluşturmak çok arzu edilen bir durumdur.
Altın nanokümeler (Au NC'ler), nedeniyle ayrık ve boyut bağımlı elektronik yapıya, 18 Onlar kapsamlı araştırma alanları çekmiştir 2 nm. 14-17 daha küçük boyutları ile metal atomları onlarca birkaç ihtiva nanomaterial özel bir tip vardır 20-23 Bu özel malzeme özellikleri, özellikle de güçlü bir floresan gibi biyolojik sistemlerde algılama ve görüntüleme. 24-32 ultrasmall floresan Au NC'ler işlevsel proteinleri kullanılarak sentezlenebilir gibi çeşitli uygulama alanı bulmaktadır. 19 ve moleküler benzeri bir emişe ve emisyon, Böyle bir şablon olarak serum albüminleri olarak. 33 tipik bir protein şablonu sentezinde Au NC'ler Au tuzları bir miktar birinci protein sarmalanır ve daha sonra proteinin kendisinin azaltılır. Protein indirgeme yeteneği alkalin çözüm artan pH ile aktive edilebilir fonksiyonel amino asit kalıntılarını (örneğin, tirosin) oluşturucu atfedilir. Protein yapısının Unfolding Au NC'ler oluşumu için kritik bir aşama olarak kabul edilir. Katlanmamış protein, daha fazla indirgeyici fonksiyonel gruplar kapsüllenmiş Au tuzları maruz olmasıdır. Protein denatüre edici maddelere karşı, ısı tedavisi veya maruz kalma ile elde edilebilir açılma. Küçük molekül ilaçların tanıtımı da orta denatürasyon sıcaklığı ve açılımı entalpilerini değiştirerek yani açılımı sürecini etkileyebilir. 34,35 Tüm bu faktörlerin etkisi, sırayla floresan Au NC'ler oluşum kinetiği ile yansıtılabilir ve tecelli Elde edilen Au NC'ler floresans yoğunluğu. 36
e_content "> Bu video daha yüksek bir sıcaklığa (60 ° C) 'de ilaç yüklü albümin proteinleri Au NCS sentezlenmesiyle, doğallık bozucu maddeler (örneğin, ürea) elde edilen Au NCS. floresan yoğunluğunun varlığında ilaç taraması yöntemini göstermektedir sinyal değerini göstermektedir. Birincisi, Au, Au NC'ler NC'ler. İkinci oluşumu kinetiklerini proteini (ısı işlemi veya denatüranlar ile yol açılan) açılma göstermek için 60 ° C ya da üre mevcudiyetinde muamele HSA ve BSA şablonlarında sentezlenir, Au NC'ler farklı ilaçlar ile önceden yüklenmiş bir protein şablonları sentezlenir, ve elde edilen Au NC'ler nispi floresan yoğunlukları ile ilaç yüklemesi etkisi nispi bağlanma mukavemeti ölçüsü sağlayan, incelenmiştir. Sonuç olarak, Au NC-ilaç tarama programı için değiştirilir sabit bir konsantrasyon protein yüklenmiş ilaç içeriğini değiştirerek, ilaç-protein bağlayıcı sabiti (KD) kantitatif ölçümü.Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemde vurgulanan gereken birkaç kritik adımlar vardır. Farklı küçük molekül ilaçların göreceli bağlanma afinitesi tarama protokolü Adımlar 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 ve nispi bağlanma gücü için tutarlı eğilimi gösteren iyi sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu adımlarda, ölçüm için reaksiyon çözümleri ekleyerek kimyasallar ve çizim eylemleri gecikme etkisi ve tutarlılığı sağlamak için uygulanmalıdır ölçümü için reaksiyon çözümleri ekleyerek kimyasallar ve çi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
Referências
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -. L., Carrupt, P. -. A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. . Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -. e. The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. . Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , (2010).
